基于SpyCatcher/SpyTag的ZEN/DON抗独特型纳米抗体的体外自组装

为了提升真菌毒素抗独特型纳米抗体的免疫分析性能,并实现双特异性检测抗原的模拟,本研究以玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)的抗独特型纳米抗体N28、Z6为研究对象,将SpyCatcher/SpyTag标签与N28、Z6分别进行融合表达,在此基础上基于体外自组装的方式,开展N28、Z6的双价、双特异性抗独特型纳米抗体的构建研究。结果表明,实现了四种SpyCatcher/SpyTag标签融合抗独特型纳米抗体N28-SpyCatcher、N28-SpyTag、Z6-SpyCatcher、Z6-SpyTag的原核可溶表达。基于Z6-SpyCatcher、Z6-SpyTag所建立的竞争抑制标准曲线的IC_(50)分别为0.18、0.20 ng/mL,其灵敏度高于单体Z6的IC_(50)(0.28 ng/mL);SpyCatcher标签与N28融合后有利于N28检测灵敏度的提升,IC_(50)值由94.39降低至42.33 ng/mL,而SpyTag标签与N28融合后,则抑制了其与DON抗体的结合。此外,在4℃反应12 h的简单反应条件下,基于SpyCatcher/SpyTag的体外自组装特性,成功制备了Z6、N28的双价、双特异性抗独特型纳米抗体Z6-Z6、N28-28与N28-Z6、Z6-N28。ELISA的鉴定结果表明,双价抗独特型纳米抗体均保留了与对应抗体的结合特性,其中N28-Z6还实现了同时与ZEN、DON抗体的结合活性,由于SpyTag标签与N28结合会阻碍其与DON抗体的结合,因此Z6-N28仅保留了与ZEN抗体结合的活性。综上,本研究基于SpyCatcher/SpyTag实现了ZEN/DON双价、双特异性抗独特型纳米抗体的简便快速制备,同时提示SpyCatcher标签对于ZEN/DON抗独特型纳米抗体的免疫分析性能提升具有促进作用。

抗独特型抗体在CD47单抗治疗患者抗体筛查和配血中的应用

目的 对接受CD47单克隆抗体治疗的受试组患者使用CD47抗独特型抗体(CD47 anti-idiotypic antibody, CD47 AID)中和法(方法1)与缺乏抗IgG4抗人球蛋白法(方法2)进行输血前抗体筛查和主侧配血,比较经此两种方法配血后的输注效果,以评估CD47 AID中和法的可行性。方法 对本院接受CD47单克隆抗体治疗的18位临床受试者用药物后标本,使用方法1与方法2进行抗体筛查和主侧配血,比较输血后血红蛋白差值ΔHb(输血后Hb-输血前Hb)是否有差异;比较使用方法1进行配血的受试组患者与对照组患者(使用普通微柱凝胶法配血且未使用CD47单抗)输血后ΔHb是否有差异。结果 使用方法1与使用方法2进行配血的患者输血后ΔHb比较,两者之间无统计学差异(8.40±0.71 vs 7.36±0.94,P>0.05);使用方法1进行配血的受试组患者与未使用CD47单抗的对照组患者输血后ΔHb比较,两者之间无统计学差异(8.40±0.71 vs 6.59±0.77,P>0.05)。结论 受试组患者采用方法1配血具有与方法2配血相同的输注效果,且具有操作简单、结果客观准确的特点,推荐使用方法1对使用CD47单抗的患者进行输血前抗体筛查及主侧配血。

抗SARS抗体独特型单链抗体的筛选及鉴定

目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础。方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白(Ig)作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG(IgM)结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性筛选,从而获得抗SARS病毒的独特型抗体(AId)。通过4轮“吸附-洗涤-扩增”,从最后一轮所得单克隆菌株中分别通过ELISA筛选出能和SARS病人恢复期血清Ig结合的菌株,提取质粒DNA,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,最后用所筛选的克隆通过与不同人群血清反应,证实其特异性。结果随机挑选经第4轮筛选后的200个单克隆菌落,其中有10个与SARS病人恢复期血清Ig结合的OD值明显高于其与正常人Ig结合的OD值;以上10个克隆经PCR扩增,其中有6个克隆于1 000 bp处有电泳条带;其DNA序列经与BLAST数据库和IMGT/QUEST软件比对有5个均与人的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)高度同源,且与其同源性最高的人Ig的VH属VHI亚群,VL属k链,属VKⅡ亚群;最后确认有3个克隆其噬菌体抗体和SARS病人血清Ig结合的OD值均明显高于与正常人血清Ig结合的OD值。结论利用抗体库技术可不经免疫制备特异性抗SARS抗体独特型抗体,为SARS诊断及疫苗的研制奠定基础。

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 。

用单克隆抗独特型抗体NP30检测血吸虫病短程抗体的研究

为证实用日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０制备的抗体检测试剂盒考核治疗效果的价值，采用双“抗原”夹心酶联免疫吸附试验，用ＮＰ３０替代抗原，检测血吸虫病抗体。结果：该试剂盒对急性感染者的检出率为１００％，慢性轻度感染者的检出率为６１％，特异性为１００％。急性感染和慢性感染的Ｙｏｕｄｅｎ指数（ｒ）分别为１．０和０．６１，慢性感染者与经典抗体检测法ＳＥＡ／ＥＬＩＳＡ（０．６０）的ｒ无差别。用此试剂盒检测血吸虫病治疗后１ａ的血清，阴转率达１００％，明显优于经典抗体检测法（４３．６％）。结论：ＮＰ３０检测的抗血吸虫抗体属短程抗体，该试剂盒具有与循环抗原检测相同的考核疗效价值。

钙纳米颗粒作为血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的研究

目的 探索钙 (Ca)纳米颗粒作为日本血吸虫病抗独特型抗体 NP30疫苗佐剂的可行性。方法 将钙纳米颗粒与 NP30制备成 Ca- NP30结合物 (Ca- NP30 ) ,主动免疫 BAL B/ c小鼠 ,观察其对小鼠的保护性作用并探讨其免疫保护机制。结果 Ca纳米颗粒可增强 NP30对宿主的保护性作用 ,减虫率明显提高 ,从单用 NP30的 30 .4%提高到 5 7.8% ;血清特异性抗体 Ig G水平较对照组显著升高 ;足垫试验可引发迟发型变态反应。结论 Ca纳米颗粒可作为血吸虫病抗独特型抗体 NP30疫苗的佐剂 ,其作用机制与同时引起宿主体液免疫和细胞免疫应答增强有关。

封闭抗体的抗独特型抗体在反复自然流产中的应用价值

为了观察在反复自然流产（ＲＳＡ）中独特型抗体－抗独特型抗体网络的作用，分别测定正常生育组、原发性ＲＳＡ、继发性ＲＳＡ的封闭抗体效率（Ａｂ１）和抗独特型抗体（Ａｂ２），以及原发性ＲＳＡ免疫治疗前后Ａｂ２的变化。结果发现：正常生育组的Ａｂ１和Ａｂ２分别为７．５３％和１０．７０％；而原发性ＲＳＡ分别为－５５．５１％和－４２．６８％；继发性ＲＳＡ则分别为２９．９８％和－３０．００％，免疫治疗前后，原发性ＲＳＡ患者体内的Ａｂ２水平有明显差异，并随着免疫次数的增多，Ａｂ２水平有逐渐增高趋势。结果表明：原发性ＲＳＡ主要是因为体内缺乏ＴＬＸ的封闭抗体及其抗独特型抗体，而继发性ＲＳＡ仅显示封闭抗体的抗独特型抗体缺乏。因此封闭抗体的Ａｂ２可区分ＲＳＡ临床型并作为ＲＳＡ诊疗措施的重要指标。

卵巢癌抗独特型微抗体主动免疫治疗卵巢癌动物实验

目的用模拟人卵巢癌抗原并有满意免疫原性的抗独特型微抗体进行临床前动物实验研究。方法将已构建的抗独特型微抗体融合基因在大肠杆菌进行表达,用Westernblot、竞争抑制ELISA进行微抗体活性测定。20只人淋巴细胞免疫功能重建的荷卵巢癌腹腔瘤SCID小鼠分2组,10只用微抗体免疫后取血采用间接ELISA检测Ab3。观察小鼠腹腔积液生成时间、生存期,取脾做流式细胞分析CD4+、CD8+。结果在宿主大肠杆菌BL21(DE3)成功诱导表达出微抗体,Westernblot结果表明微抗体可同时与COC166-9(6B11的一抗)及羊抗人的IgG1反应。竞争抑制ELISA表明微抗体可模拟原始抗原与一抗结合。微抗体免疫小鼠后可诱导产生Ab3,在末次免疫14d时最高,持续6周降至对照组水平;CD4+/CD8+在末次免疫13d达最高值。对照组和微抗体治疗组小鼠分别在(37.7±5.5)d和(48.6±14.3)d长出血性腹腔积液(P=0.04);两组小鼠生存期分别为(42.5±1.8)d和(59.4±16.8)d(P=0.011)。结论微抗体保留了6B11scFv和人IgG的双重免疫学活性,达到了部分人源化的目的,并有满意的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应,抑制荷瘤小鼠腹腔积液的生成,延长生存期,或许将来可作为卵巢癌疫苗用于临床。

噬菌体抗体库技术筛选结肠癌单抗MC3的抗独特型抗体

目的 :获得结肠癌单抗MC3的噬菌体呈现型抗独特型抗体 (anti Id)。方法 :分离经单抗免疫鼠脾脏的mRNA ,经RT PCR分别扩增抗体VH和VLDNA ,进而连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7挽救后获得噬菌体呈现型ScFv文库。以MC3对文库进行四轮筛选后 ,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现anti IdScFv的噬菌体单克隆。结果 :VH、VL和ScFvDNA分别约为 34 0、32 0和 75 0bp。抗体ScFv文库经四轮筛选后 ,在随机筛检的 5 0个克隆中得到 15个呈现anti IdScFv的噬菌体单克隆。结论 :用噬菌体抗体库技术成功地获得了单抗MC3的anti IdScFv,从而为进行结肠癌重组anti

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选

背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。

抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的制备及鉴定

利用具有中和活性的抗鳗弧菌单克隆抗体 4A6作为免疫原 ,通过单克隆抗体技术制备出 7株分泌抗独特型单抗的杂交瘤细胞。以ELISA竞争抑制实验及诱导Ab3的功能实验证实 ,其中 4株属于Ab2 β,有可能用于疫苗生产。

带有HBsAg表位内影像的单克隆抗独特型抗体的建立和鉴定

本文采用鼠单克隆抗-HBs(Ab_1)作抗原免疫同系鼠,取免疫鼠的脾细胞与SP_2/0骨髓瘤细胞融合,经过反复筛选、克隆化获得两株(B_3,C_2)持续分泌单克隆的抗独特型抗体其(Ab_2)。对其中之一B_3作了深入鉴定。B_3的Ig类型为IgG,亚类为IgG_2a。核型分析结果染色体数为106条。通过ELISA抑制试验对B_3进行鉴定,发现B_3一方面能与纯化HBsAg发生阳性的竞争性抑制,另一方面又能与不同来源的抗-HBs发生结合,出现阳性的中和抑制。无论竞争性抑制还是中和抑制,都呈现剂量依赖关系。将B_3Ig免疫同系鼠,经一次免疫后就能诱导出具有抗-HBs活性的抗-抗-独特型抗体(Ab_3)。以上结果表明:B_3株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗独特型抗体是带有HBsAg表位内影像的单克隆抗体。并对B_3Ig的可能应用意义进行了讨论。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对虫卵肉芽肿免疫调节作用的研究

目的研究日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０对虫卵肉芽肿的影响。方法 ＮＰ３０腹腔注射主动免疫ＩＣＲ小鼠，对照组腹腔注射ＳＰ２／０腹水，分别在尾蚴攻击感染后第４、８、１２、１６、２０、２４周处死，观察和比较肝内虫卵肉芽肿的形成和演变。应用计算机图像分析技术，测量虫卵肉芽肿大小。结果尾蚴攻击感染第 １２周以后， ＮＰ３０免疫组虫卵肉芽肿的直径明显低于 ＳＰ２／０对照组，虫卵肉芽肿的演变时相提前，并出现２种特殊类型的肉芽肿。结论ＮＰ３０能减轻日本血吸虫对宿主造成的免疫病理损害。

黄曲霉毒素B_1抗独特型抗体的制备和应用研究I 抗独特型抗体的制备和性质研究

以黄曲霉毒素B1(AFB1)与牛血清蛋白(BSA)的连接物AFB1-BSA注射免疫兔子获得抗AFB1抗血清,经(NH4)2SO4沉淀、酶切处理与亲和层析分离纯化后,得到抗AFB1独特型抗体Ab1及其酶切片段Fab1,然后再将Fab1注射免疫BALB/c小鼠,得到抗(抗AFB1)独特型抗体Ab2及其酶切Fab2。研究了Ab2和Fab2的性质,结果表明,Ab2和其Fab2都仅与Ab1及其Fab1反应,而不和抗桔霉素等其他抗体反应,有较好的特异性。以AFB1与卵清蛋白(OV)的连接物AFB1-OV为包被抗原,Fab1为反应抗体,Ab2和Fab2为竞争抗原,达到50%的竞争抑制率时,Ab2和Fab2的浓度分别为3.98ug/ml和1.12ug/ml;而以Ab2和Fab2为包被抗原,Fab1为反应抗体,AFB1为竞争抗原,达到50%的竞争抑制率时,AFB1的浓度分别为44.67ug/L和6.31ug/L,这表明无论是Ab2还是Fab2都和AFB1有很好的内影像关系,可以作为AFB1的替代品用于AFB1的免疫学检测。但是相对而言,由于Fab2的分子量小,反应时的空间位阻小,所以Fab2更适合于用作AFB1的替代品。

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。

金属螯合亲和层析法对人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的纯化

在重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的表达质粒（ｐＱＥＨｖ）的氨基端插入６个组氨酸，使其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用ＮｉＮＴＡ螯合层析介质，以咪唑洗脱表达的蛋白。经ＥＬＩＳＡ检测，纯化的蛋白可特异地与抗宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠ｍＡｂ５Ｂ１２发生反应。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-IdscFv),为研制HCVE2的抗-IdscFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCVE2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCVE2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCVE2特异性抗-IdscFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-IdscFv与HCVE2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450nm)值较高(E11A450nm0.928,E14A450nm1.152,E17A450nm1.136,E28A450nm1.163,E53A450nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11A450nm0.044,E14A450nm0.062,E17A450nm0.166,E28A450nm0.012,E53A450nm0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株(E28)阳性克隆.提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCVE2的抗-IdscFv,本实验结果为开展用抗-IdscFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.

鼻咽癌抗独特型抗体诱导的体液和细胞免疫应答

目的探讨抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3模拟抗原诱导免疫应答的能力。方法用Ab2免疫Balb/c小鼠获得抗血清 ,以ELISA检测其Ab3,WesternBlot分析其识别抗原的分子质量。用迟发型超敏反应(DTH)和淋巴细胞增殖试验 ,检测Ab2诱发细胞免疫反应的能力。结果2H4,5D3免疫同系动物产生的含有抗抗独特型抗体(Ab3)的抗血清 ,可特异性地与靶细胞结合。FC2(Ab1)和经2H4免疫的Ab3可识别相对分子质量(Mr)相同约68000的抗原 ,且不同于HNL5(Ab1)和5D3免疫的Ab3所识别的抗原(Mr80000)。在DTH试验中 ,所致小鼠足垫肿大的程度 ,2H4和5D3实验组均显著高于对照组。而在淋巴细胞增殖试验中 ,Ab2免疫鼠脾T细胞在体外对靶细胞或Ab2的再次刺激呈现明显的细胞增殖反应 ,而无关肿瘤细胞或抗体的刺激则不能引起细胞增殖。结论抗独特型抗体2H4和5D3具有鼻咽癌相关抗原的内影像 ,能模拟不同分子质量的鼻咽癌相关抗原诱导体液和细胞免疫应答。