用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

目的构建组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kiwi pectin methylesterase inhibitor,kwPMEI)的毕赤酵母(P.pastoris)GS115工程菌株,探索碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)对重组菌表达kwPMEI的影响,纯化kwPMEI并鉴定其对番茄果胶酶的抑制活性。方法应用PCR方法从P.pastoris GS115染色体中扩增了三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP),以其取代诱导型表达载体pPIC9K-kwPMEI上的醇氧化酶启动子(pAOX1),构建了组成型表达载体pGAP9K-kwPMEI,并转化至GS115中。用Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白表达情况,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,并用凝胶扩散方法鉴定其抑制活性。结果重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达了kwPMEI,48 h即达到最大表达水平,表达量约为66 mg/L。并且以甘油为碳源时kwPMEI表达量最高。成功分离纯化了kwPMEI,并经凝胶扩散方法检测表明其具有抑制活性。结论成功构建了组成型分泌表达kwPMEI的毕赤酵母菌株,为kwPMEI在果蔬汁中的进一步应用奠定了基础。

重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化

在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始p H、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kw PMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条件。结果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、p H5.5、在BMMY培养基中诱导表达5 d为最佳条件。该重组蛋白kw PMEI1的表达量最高可达700.302 mg/L。

不同发酵条件对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂表达量的影响

将已在毕赤酵母中成功表达的重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂为研究对象,通过改变发酵培养时间、培养基装填量及培养基配方,对该重组蛋白的表达量进行研究。最终确定使用BMMY培养基、表达时间为96h、培养基装填量为10%时为最佳表达条件,在最佳表达条件下,该重组蛋白的表达量最高可达0.2g/L。

重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的抑制活性研究

猕猴桃的果胶甲酯酶抑制剂可有效抑制不同种类植物的果胶甲酯酶活性。主要研究在巴斯德毕赤酵母中成功表达的重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(被命名为kWPMEI)的抑制活性。通过研究发现,kWPMEI对桔子果胶甲酯酶的抑制活性最强,其次是胡萝卜,最弱的是番茄。同时kWPMEI对上述三种植物果胶甲酯酶的抑制活性受环境温度和pH的影响比较显著。

果胶甲酯酶抑制剂的异源表达及其在果酒降甲醇中的应用

该文从猕猴桃中克隆出果胶甲酯酶抑制剂(Pectin Methylesterase Inhibitor,PMEI)基因,经EcoRI/XbaI双酶切后连接到表达载体pPICzαA上,电转化到毕赤酵母GS115筛选出阳性菌株GS115/pPICzαA-PMEI,并将重组酵母表达的PMEI浓缩纯化后应用于果酒发酵。研究结果表明:重组毕赤酵母表达菌株GS115/pPICzαA-PMEI成功构建,PMEI的发酵表达量为35.38 mg/L。将PMEI应用到果酒发酵中,桔子酒甲醇降低47.54%,含量由189.75 mg/L降低到99.55 mg/L;苹果酒甲醇降低21.52%,含量由118.15 mg/L降低到91.20 mg/L;葡萄酒甲醇变化不显著,含量均低于20.00 mg/L,表明PMEI对果胶丰富且内源性果胶酶强的桔子具有明显的降甲醇效果。桔子酒发酵工艺优化的PMEI最低抑制质量浓度8.84 mg/L,最适温度18℃,此时桔子酒中的甲醇降低66.40%到89.10 mg/L。这为低甲醇果酒的发酵提供了新的技术路线。

超高压和酶抑制剂联合处理对荔枝果肉中过氧化物酶和果胶甲基酯酶的影响

为了研究超高压与酶抑制剂联合处理对荔枝果肉中过氧化物酶(POD)和果胶甲基酯酶(PME)的影响,将荔枝(“淮枝”品种)果肉在两种酶抑制剂组合溶液(A:5 g/L柠檬酸+2.5 g/L L-抗坏血酸+5 g/L氯化钙;B:10 g/L柠檬酸+5 g/L L-抗坏血酸+10 g/L氯化钙)中分别浸泡10 min,并在100-400 MPa压力、10℃温度条件下处理30 min,采用分光光度法测定果肉中POD、PME的活性。结果表明:A、B两种组合处理能够明显钝化POD,但却显著激活了PME;超高压与A组合联合处理不能使POD、PME活性下降;超高压与B组合联合处理对POD、PME的影响与压力值有关系,100-300 MPa的超高压与B组合联合处理使POD活性下降,200-400 MPa的超高压与B组合联合处理则使PME活性升高。因此,超高压与酶抑制剂联合处理对荔枝果肉中POD的钝化存在一定的协同效应,且浓度越高,协同抑制效应越明显;而超高压与酶抑制剂联合处理对荔枝果肉中PME的钝化却表现出一定的拮抗性。

超高压与重组果胶甲酯酶抑制剂联合应用对鲜榨橙汁果胶甲酯酶活性及品质的影响

为了探究超高压与重组果胶甲酯酶抑制剂(recombinant pectin methylesterase inhibitor,rPMEI)联合处理对鲜榨橙汁中果胶甲酯酶(pectin methylesterase,PME)活性及品质的影响,研究了超高压(400、500和600 MPa,5 min,20℃)与重组果胶甲酯酶抑制剂对橙汁微生物、PME酶活、色泽和VC含量的影响。结果表明:超高压处理条件为500 MPa/5 min,rPMEI添加浓度为0.06 mg/mL时,橙汁中的菌落总数、霉菌与酵母菌数均能达到农业行业标准《NY/T434-2016绿色食品、果蔬汁饮料》所规定的要求,同时PME被完全钝化;橙汁色泽变化显著小于热处理组(ΔE^*=1.22<2.26);VC保留率为85.1%,显著高于热处理组(保留率=8.33%)。

白桦果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)基因克隆及序列分析

从白桦(Betula platyphylla Suk.)cDNA文库中获得1个果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长946 bp,其ORF全长624 bp,编码208个氨基酸,编码蛋白的分子量22 486.4D,理论等电点为10.09,保守区分析确定其含有PMEI蛋白保守序列,属于植物PMEI超家族。该结果为研究白桦细胞壁代谢的分子调控奠定了基础。

植物果胶甲酯酶与果胶甲酯酶抑制子研究进展

果胶是植物细胞壁的主要组分,存在于胞间层与中间层,影响细胞的流变性与黏附性能。果胶的甲酯化程度影响果胶形态,对稳定细胞壁性质以及植物生长发育过程具有重要作用。果胶甲酯酶(PME)是果胶去甲酯化修饰的关键酶类,果胶甲酯酶抑制子(PMEI)可特异地结合PME,调节其活性,共同决定果胶的去甲脂化。本文综述了PME与PMEI的结构及生化作用机制、相关基因家族和表达模式,并进一步对二者介导的果胶去甲酯化过程对细胞壁的影响及其与花粉管发育、根器官形成等植物生长发育过程和逆境响应关系的最新研究进展做了介绍,并进行了展望。

基于酶三维结构的乙酰胆碱酯酶抑制剂-石杉碱甲及类似物研究

石杉碱甲是我国首先从石杉属植物Haperzia serrata(Thunb.)Trev.中分离得到的一种新的生物碱,具有明显的抗胆碱酯酶作用,对老年痴呆病人可明显改善其记忆功能。从基于酶的三维结构出发对石杉碱甲及其类似物作用于乙酰胆碱酯酶(AChE)的作用机理进行了理论计算研究。首先以同源的电鳐乙酰胆碱酯酶的三维晶体结构为模板,构建人乙酰胆碱酯酶(H.AChE)的三维结构和活性中心的组成,再用分子模拟方法和分子力学方法得到石杉碱甲类似物-AChE复合物的结构,并计算石杉碱甲和AChE结合时的相互作用能,发现其与活性之间有相关性。用半经验量子化学计算方法AM1计算了石杉碱甲类似物活性构象的电子结构,用偏最小二乘(PLS)方法对上述相互作用能、HOMO和LUMO轨道能级对活性进行回归,得到了活性与上述参数间的定量构效关系,发现石杉碱甲类似物与AChE可能形成电荷转移复合物,并且两者之间的前线轨道参数与石杉碱甲类化合物与AChE的相互作用,进而影响石杉碱甲的活性。

松材线虫乙酰胆碱酯酶1基因沉默及蛋白抑制剂

【目的】为提高苦参碱的杀虫效果,对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶1基因(Bx ACE1)进行研究。【方法】松材线虫采集自广东省内马尾松,贝曼漏斗法分离,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫。克隆Bx ACE1基因全长并进行序列分析,通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断该基因功能,研究苦参碱的杀虫效果,并应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果。【结果】5'和3'序列拼接得到基因全长2 145 bp,命名为Bx ACE1。同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致。蛋白质三维结构分析表明,Bx ACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠,鉴于氢键数量越多结合越稳定,利用docking技术筛选出石杉碱甲是松材线虫乙酰胆碱酯酶1蛋白的较佳抑制剂。RNAi明显增加了苦参碱的杀虫效果,石杉碱甲本身对线虫毒性较小,共同施用RNAi和石杉碱甲对线虫毒性仍然较小,但RNAi处理组线虫与Inhibitor(0.03%苦参碱+1μmol·L-1石杉碱甲处理线虫)处理组线虫在24,48及72 h存活率差异不显著,表明石杉碱甲处理线虫和Bx ACE1基因RNAi处理效果相近。【结论与其他】通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断Bx ACE1功能均可以提高苦参碱的杀虫效果,RNAi技术能够简单易行地证明若阻断Bx ACE1功能可以提苦参碱的杀虫效果,但dsRNA容易降解等因素限制了该技术在生产实践中的广泛应用。石杉碱甲可以与Bx ACE1稳定结合,鉴定表明石杉碱甲可以提高苦参碱的杀虫效果,具有生防药剂辅剂的开发潜力,可替代基因沉默技术实现抑制Bx ACE1的目的。因此,通过乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲可阻断Bx ACE1的功能,进而达到提高苦参碱等植物源药剂杀虫效果的目的。ACEIs通过抑制线虫体内的乙酰胆碱酯酶的活性,使线虫体内的胆碱水平短时间内大量提高,从而导致其中毒死亡。该类具有代表性的杀虫剂是有机磷类化合物和氨基甲酸酯类化合物,大多为非可逆型ACEIs。石杉碱甲是来源于石杉科植物蛇足石杉的一种半萜生物碱,是一种高效、高选择性、可逆性的ACEIs。本研究将石杉碱甲引入松材线虫研究,是对该植物源药剂的一个新尝试。

猕猴桃果实中PME,PG及其抑制因子的研究(综述)

本文综述了猕猴桃中的PME，PG在果实软化中的作用、分离提纯、性质和活力测定方法，以及这两种酶的抑制因子等方面的研究进展。PME与猕猴桃果实的软化无直接关系，可能是通过为PG准备作用底物而起间接的促进软化的作用。猕猴桃果实内PME的抑制因子是一种糖蛋白，仅对PME有专一性的抑制作用。猕猴桃采后PG活性的上升促进果胶物质的水解是导致猕猴桃果实软化的重要原因。猕猴桃果实中存在一种专一性的猕猴桃蛋白酶（Actinidin），能抑制PG的活性，该蛋白酶可被巯基乙醇和DTT等所激活，也可被leupeptin和PCMB所抑制。

老年痴呆症药物石杉碱甲类似物研究VI.(-)-14-去甲基石杉碱甲的不对称全合成及其乙酰胆碱酯酶抑制活性

目的 (- ) 1 4 去甲基石杉碱甲的合成及其抑制乙酰胆碱酯酶活性研究。方法 从 β 酮酯 3与 2 亚甲基 1 ,3 丙二醇双醋酸酯 4在手性膦配体钯催化下 ,对映选择性的形成双环化合物 5 ,双键移位后得到关键中间体 6 ,进而复结晶富集后 ,得到光学纯 6。经Wittig反应 ,得双键化合物 7,酯基水解后 ,得到相应酸 8。经改良的Curtius重排 ,产生氨基甲酸酯 9。除去保护后 ,得目标化合物 2。结果 (- ) 1 4 去甲基石杉碱甲仅是天然 (- ) 石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性 1 8。结论 由电鳐乙酰胆碱酯酶与 (- ) 石杉碱甲复合物X 射线衍射结构分析揭示 ,1 4 甲基与酶形成氢键是 (- )

软枣猕猴桃果胶分解酶基因克隆及表达量分析

以不同软化阶段的软枣猕猴桃果实为试材,采用分光光度法测定了多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)和果胶甲酯酶(Pectin methylesterase,PME)活性,采用RT-PCR法对其控制基因克隆,并对不同成熟阶段的表达进行了分析,以期探讨软枣猕猴桃果实软化机理。结果表明:软枣猕猴桃果实软化中PME和β-gal在软化初期出现活性高峰,PG在软化期形成活性高峰,而且成功克隆得到了软枣猕猴桃PG和β-gal的基因序列。NCBI Blast结果表明与中华猕猴桃PG基因和β-gal基因的一致性分别大于95%和90%。PG基因的半定量分析表明PG基因的转录表达与PG活性协同一致,说明在软枣猕猴桃果实中PG基因的表达是转录水平上调控的;而β-gal基因的半定量分析表明β-gal活性波峰结果一致,但是与果实软化过程中β-gal保持较高的酶活性结果不一致,说明β-gal基因的表达不仅受到转录水平的调控,还可能受到翻译水平上的调控。

一类新型乙酰胆碱酯酶抑制剂的研发

文章利用中药天麻的活性成分对羟基苯甲醛为起始原料,设计合成出一系列2-取代-2-〔2-(4-甲酰基苯氧基)乙酰胺基〕乙酸甲酯衍生物。其中化合物4b和4i的乙酰胆碱酯酶抑制活性比临床用药加兰他敏更强,且对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶表现出高度的选择性。

一种制备高纯果胶酯酶的方法研究

采用温度控制结合抑制剂的方法对高纯果胶酯酶酶制剂的制备方法进行研究。通过正交试验,得到制备高纯果胶酯酶制剂的最优工艺条件是:温度55℃,七水合硫酸亚铁(FeSO.47H2O)浓度1 mol/L,时间10 min。在此条件下,果胶酯酶酶活残余为80.57%,而聚半乳糖醛酸酶的活力仅仅残留了8.29%。

阿莫西林、甲硝唑、果胶铋抗HP疗效观察

幽门螺旋杆菌（HP）感染率较高，目前治疗为联合应用质子泵抑制剂（PPI）、铋剂、抗生素的“三联”或“四联”疗法。接受2004年4月～2005年4月我院收治的消化性溃疡、慢性胃炎（胃黏膜糜烂、中-重度萎缩、中-重度肠化或异型增生）病人合并HP感染者210例（无青霉素过敏史），接受抗HP治疗，现报告如下。

果胶甲酯化修饰与果实质地变化研究进展

甲酯化修饰发生在果胶主链的自由羧基,与果实质地变化密切相关。近年来,基于模式植物的研究揭示:果胶甲酯化修饰在植物生长发育和抗逆等生物学途径中具有关键调控作用,然而,果胶甲酯化修饰在果实领域的研究尚处于起步阶段。本文从果胶甲酯化修饰的概况、研究方法、生物学功能,与果实质地变化的关系及调控机制5个方面综述果胶甲酯化修饰与果实质地变化的研究进展,旨在为相关研究提供参考。