猪β-防御素-2在黄曲霉毒素B1致小鼠肠道炎症损伤中的作用

旨在探究猪β-防御素-2(pBD-2)在黄曲霉毒素B1(AFB1)致鼠肠道损伤中的作用。本试验以4周龄KM小鼠为研究对象,将体重相近的30只健康小鼠随机均分为5组,分别为空白对照组(不做任何处理)、DMSO组(1%DMSO灌胃)、AFB1组(0.3 mg/kg AFB1灌胃)、pBD-2组(0.03 mg/kg pBD-2灌胃)和AFB1+pBD-2组(0.3 mg/kg AFB1灌胃28 d后再用0.03 mg/kg pBD-2灌胃28 d),试验持续56 d,通过观察小鼠肠道结构的变化以及采用qPCR和免疫荧光的方法检测炎症相关因子的表达水平。结果:与对照组相比,AFB1组小鼠的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)均呈现显著下降趋势(P<0.05),料重比(F/G)降低,但差异不显著(P>0.05),而小鼠饲喂pBD-2以后ADG和ADFI均较AFB1组显著增加(P<0.05);HE染色结果显示,AFB1导致小鼠空肠黏膜显著损伤,并伴有严重的肠壁变薄,肠绒毛萎缩、稀疏,肠绒毛高度与隐窝深度之比、相对肠绒毛数量及肠壁厚度均显著降低(P<0.05),而使用pBD-2处理小鼠损伤模型,肠道结构可见显著恢复(P<0.05);qPCR和免疫荧光染色结果表明,AFB1处理小鼠可显著上调白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对白细胞介素-8(IL-8)的表达水平出现了下调趋势,而用pBD-2处理小鼠损伤模型后可显著下调炎症因子的表达水平,说明pBD-2对AFB1造成的肠黏膜炎症具有缓解作用。本研究结果为AFB1中毒的防控及pBD-2在畜牧生产中的应用提供了科学依据。

意大利蜜蜂防御素-2蛋白序列分析及表达特性研究

【目的】对意大利蜜蜂(Apis mellifera)防御素-2蛋白(Defensin-2,Def-2)进行蛋白序列分析和表达特性研究,以期为意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御机制、发育和代谢途径研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学在线网站及软件对Def-2蛋白进行预测分析,并采用实时荧光定量PCR对意大利蜜蜂不同发育时期(幼虫期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂)的基因相对表达量进行检测分析。【结果】意大利蜜蜂防御素-2基因(Def-2)编码104个氨基酸残基,相对分子量为11858.90 Da,理论等电点(pI)为8.54,为两性不稳定蛋白。该蛋白N-末端有一段含21个氨基酸的信号肽,存在1个跨膜结构域,亚细胞主要定位于内质网、液泡和高尔基体,无糖基化位点,存在15个磷酸化位点,其二级结构以无规卷曲(54.81%)为主、延伸链(28.85%)分布较多,α-螺旋(16.35%)分布较少,蛋白序列高度保守,与Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd等蛋白存在基因互作关系,具有防御蛋白样结构域(DEFL),结构域采用以半胱氨酸稳定的α/β支架为特征的结构,亲缘关系与小蜜蜂极为相近。Def-2基因在意大利蜜蜂不同发育时期的表达水平存在差异且随日龄增大而升高,30 d的相对表达量显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】意大利蜜蜂Def-2蛋白属于两性不稳定蛋白,参与细胞间信号传输并维持细胞正常形态;蛋白序列高度保守,亲缘关系与小蜜蜂最近,且该基因在30 d成年期工蜂中高丰度表达,推测其可能调节免疫基因转运而影响蜜蜂的免疫识别过程。

肺结核患者血清甲壳质酶蛋白40、β-防御素-2水平及其对肺结核的诊断价值

目的探索肺结核患者血清甲壳质酶蛋白40(chitinase protein 40,YKL-40)、β-防御素-2(human beta defensin 2,HBD-2)水平及其对肺结核的诊断价值。方法选取2021年6月—2023年6月山东省立医院收治的86例肺结核患者为肺结核组,根据痰涂片结果分为活动性肺结核组(n=50)和非活动性肺结核组(n=36),另选取86例来自我院体检中心的健康受试者作为对照组。检测所有受试者血清中YKL-40、HBD-2水平并分析肺结核患者血清中YKL-40与HBD-2的相关性;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清中YKL-40、HBD-2水平对肺结核及活动性肺结核的诊断价值。结果肺结核组血清YKL-40、HBD-2水平高于对照组(P均<0.05);活动性肺结核组血清YKL-40、HBD-2水平高于非活动性肺结核组(P均<0.05)。肺结核患者血清中YKL-40与HBD-2的水平呈正相关(r=0.601)。YKL-40、HBD-2及2者联合诊断肺结核的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.895、0.922、0.962,2者联合诊断优于单独诊断;YKL-40、HBD-2及2者联合诊断活动性肺结核的AUC分别为0.891、0.881、0.959,2者联合诊断优于单独诊断。结论肺结核患者血清YKL-40、HBD-2水平显著升高,且随病情加重而升高,2者对肺结核及活动性肺结核的具有一定的诊断价值。

血清β-防御素-2、维生素E联合超敏C反应蛋白对急性下呼吸道感染患儿的诊断价值

目的 探讨血清β-防御素-2(hBD-2)、维生素E联合超敏C反应蛋白(hs-CRP)对急性下呼吸道感染的诊断价值。方法 以2021年1月至2022年4月在安徽省合肥市第八人民医院确诊治疗的86例急性下呼吸道感染患儿作为病例组,根据检测结果将86例急性下呼吸道感染患儿分为病毒性感染组(55例)和细菌性感染组(31例),另选择同期34例健康体检者为对照组。检测三组患儿血清hBD-2、维生素E及hs-CRP表达,应用Pearson相关性分析血清hBD-2、维生素E及hs-CRP表达与急性下呼吸道感染的相关性,最后通过受试者工作特征(ROC)曲线下面积评价血清hBD-2、维生素E及hs-CRP表达对细菌性感染的诊断价值。结果 病例组患儿血清hBD-2和hs-CRP水平明显高于对照组,而维生素E水平明显低于对照组(P<0.05);细菌性感染组患儿血清hBD-2和hs-CRP水平明显高于病毒性感染组,而维生素E水平显著低于病毒性感染组(P<0.05)。相关性结果显示,观察组患儿血清hBD-2和hs-CRP与细菌性感染的发生呈正相关(P<0.001),而维生素E则与细菌性感染的发生呈负相关(P<0.001)。ROC结果显示,血清hBD-2、维生素E及hs-CRP并联联合预测细菌性感染发生的灵敏度=90.32%,特异度=94.55%,表明诊断结果具有较高的真实性;而Kappa=0.853,表明诊断结果与实际结果高度一致,具有临床应用价值。结论 血清hBD-2、维生素E、hs-CRP均可对小儿急性下呼吸道感染疾病的临床鉴别诊断提供较好的辅助诊断价值,三者并联联合试验,诊断结果与实际结果高度一致,具有临床应用价值。

血清高迁移率族蛋白B1、人β防御素2与腺病毒肺炎患儿闭塞性细支气管炎发生的关系

目的探讨血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、人β防御素2(hBD-2)与腺病毒肺炎(AP)患儿闭塞性细支气管炎(BO)发生的关系。方法选取193例AP患儿,根据出院3个月后是否发生BO将AP患儿分为BO组58例和非BO组135例。收集两组临床资料并用酶联免疫吸附试验检测血清HMGB1、hBD-2,用单因素及多因素Logistic回归分析AP患儿发生BO的影响因素,以受试者工作特征(ROC)曲线分析血清HMGB1、hBD-2对AP患儿发生BO的预测价值。结果BO组月龄小于非BO组,热程长于非BO组,低氧血症、机械通气发生比例及血液白细胞计数、血小板计数、C反应蛋白、降钙素原、HMGB1、hBD-2高于非BO组(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,低氧血症、机械通气和HMGB1、hBD-2升高为AP患儿发生BO的独立危险因素(P均<0.05)。ROC曲线分析显示,血清HMGB1、hBD-2联合应用预测AP患儿发生BO的曲线下面积为0.818,与血清HMGB1、hBD-2单独预测的曲线下面积(0.739、0.726)比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论血清HMGB1、hBD-2水平升高是AP患儿发生BO的危险因素,二者联合检测对AP患儿发生BO的预测价值较高。

25-羟基维生素D、人β防御素-2及胰岛素样生长因子1水平与痤疮患者疾病严重程度的关系

目的探讨外周血25-羟基维生素D[25(OH)D]、人β防御素-2(HBD-2)及胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平与痤疮患者疾病严重程度的相关性。方法选取128例寻常痤疮患者纳入痤疮组,另选取128例健康体检者纳入对照组。检测2组外周血25(OH)D、HBD-2及IGF-1水平。分析外周血25(OH)D、HBD-2及IGF-1水平与痤疮患者疾病严重程度的关系。分析痤疮患者外周血25(OH)D、HBD-2和IGF-1水平间的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估25(OH)D、HBD-2和IGF-1水平对重度痤疮的诊断价值。结果痤疮组外周血25(OH)D水平低于对照组,IGF-1水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组HBD-2水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。痤疮组中,随着患者疾病严重程度加重,其外周血25(OH)D水平依次降低,IGF-1水平依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。痤疮患者外周血25(OH)D水平与IGF-1水平、疾病严重程度呈负相关(r=-0.509、-0.586,P<0.05),IGF-1水平与疾病严重程度呈正相关(r=0.547,P<0.05),HBD-2水平与25(OH)D、IGF-1水平及疾病严重程度均无关(P>0.05)。外周血25(OH)D水平、IGF-1水平评估重度痤疮的敏感度分别为94.12%、61.26%,特异度分别为70.59%、77.48%,二者联合评估重度痤疮的敏感度为90.91%,特异度为71.43%。结论痤疮患者外周血25(OH)D水平降低,IGF-1水平升高,且其与疾病严重程度有关。25(OH)D、IGF-1水平联合评估重度痤疮的效能较好。

血清信号转导抑制因子3、β防御素2对胸部创伤并发细菌感染诊断价值研究

目的探讨血清细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)、β防御素2(HBD2)对胸部创伤并发细菌感染的诊断价值。方法选取自2021年7月至2023年12月收治的胸部创伤(包括以胸部创伤为主的多发伤)患者152例为创伤组,并根据其是否并发细菌感染分为感染组(n=53)和无感染组(n=99),另选取同期在本院进行健康体检的志愿者152例为健康组。采用酶联免疫吸附法检测血清SOCS3、HBD2水平;采用Pearson相关分析感染组血清SOCS3与HBD2水平的相关性;采用多因素Logistic回归分析(逐步向前法)影响胸部创伤患者并发细菌感染的因素;采用受试者工作特征曲线分析血清SOCS3、HBD2对胸部创伤患者并发细菌感染的诊断价值,并采用Z检验比较其曲线下面积(AUC)。结果创伤组血清SOCS3、HBD2水平明显高于健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。感染组创伤严重程度评分(ISS)、机械通气时间明显高于无感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。感染组血清SOCS3、HBD2水平明显高于无感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。感染组血清SOCS3与HBD2水平呈正相关(r=0.579,P<0.05)。SOCS3、HBD2、ISS评分是影响胸部创伤患者并发细菌感染的因素(P<0.05)。血清SOCS3、HBD2联合诊断胸部创伤患者并发细菌感染的AUC为0.920(95%可信区间:0.878~0.961),SOCS3、HBD2单独诊断胸部创伤患者并发细菌感染的AUC分别为0.830(95%可信区间:0.763~0.897)、0.811(95%可信区间:0.741~0.881),二者联合诊断效能较SOCS3(Z=2.252,P=0.024)、HBD2(Z=2.615,P=0.009)单独诊断效能更高。结论胸部创伤并发细菌感染患者血清SOCS3、HBD2水平异常升高,二者联合诊断胸部创伤患者并发细菌感染的价值较高。

输尿管镜碎石术后发热性尿路感染危险因素及血清β防御素2高迁移率族蛋白B1 Toll样受体4早期预测价值

目的 探讨泌尿结石疾病采取输尿管镜碎石术治疗术后发生发热性尿路感染的相关危险因素,观察血清β防御素2、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)以及Toll样受体4(TLR4)对早期预测尿路感染的价值。方法 回顾性分析122例行输尿管镜碎石术治疗者的临床资料,根据术后是否发生发热性尿路感染分成感染组与未感染组,记录患者资料,分析危险因素,此外采集2组血液分离血清,测定血清β防御素2、HMGB1、TLR4水平。结果 术后35例(28.7%)发生发热性尿路感染,多因素分析显示年龄≥60岁、手术时间≥60 min、泌尿道手术史、合并糖尿病、导尿管留置时间≥72 h、住院时间≥7 d均是输尿管镜碎石术患者术后发热性尿路感染独立危险因素(P=0.023、0.014、0.016、0.019、0.008、0.011,OR值=2.154、3.021、2.451、2.331、2.025、2.415);感染组血清β防御素2、HMGB1、TLR4检测水平高于未感染组(t=10.48、28.47、22.86,P<0.05)。结论 输尿管镜碎石术,年龄、手术时间、泌尿手术室、合并糖尿管、导尿管留置与住院时间为术后发热性尿路感染的相关危险因素,需加强防范,术后通过检测血清β防御素2、HMGB1、TLR4水平对早期预测感染价值突出,值得推广。

猪防御素基因pBD-2在大肠杆菌中的重组和融合表达

哺乳动物防御素是动物机体在抵御病原微生物的防御反应中产生的一类重要的抗菌肽物质,具有十分广泛的抗菌谱,在先天免疫上起重要作用。本研究根据已报道的pBD-2基因cDNA序列,合成了3条基因片段(1、2、3)。片段1、2和片段2、3各有15个碱基互补配对,PCR扩增延伸得到pBD-2基因,将pBD-2基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出pBD-2融合蛋白。pBD-2基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性打下了基础。

ACE2对猪流行性腹泻病毒体外感染传代猪小肠上皮细胞的影响

为探究血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染仔猪过程中发挥的作用,本研究通过转录组学分析仔猪肠道ACE2在PEDV感染前后表达的变化情况,然后利用猪小肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cells, IPEC-J2细胞)模型,通过RT-qPCR、Western blot检测PEDV感染后ACE2的mRNA、蛋白表达水平的变化。过表达与抑制表达ACE2后通过RT-qPCR、Western blot、TCID50检测PEDV复制水平。结果显示,PEDV感染IPEC-J2后ACE2的mRNA及蛋白表达水平均显著下调,与转录组学结果一致。过表达ACE2组PEDV感染量显著上升,抑制表达ACE2组PEDV感染量显著下降。本研究在细胞水平上验证了ACE2在PEDV感染过程中的作用,即PEDV感染能够使ACE2表达量下降,在IPEC-J2细胞中过表达ACE2能提高PEDV复制水平,抑制ACE2的表达可降低PEDV复制水平。

1,25(OH)_(2)D_(3)及VDR敲除对山羊附睾头上皮细胞β防御素家族表达的影响

旨在研究1,25(OH)_(2)D_(3)是否通过VDR途径调节山羊附睾头上皮细胞β防御素基因表达。本试验选取3只6月龄太行黑山羊,分别采集附睾头组织。采用差速贴壁法分离山羊附睾头上皮细胞,用细胞免疫荧光鉴定上皮细胞纯度。添加100 nmol·L^(-1)1,25(OH)_(2)D_(3)处理附睾头上皮细胞以及筛选出敲除效率最高的pCas9/gRNA1质粒载体进行细胞转染,同时设置阴性对照组和空白对照组,每组3个重复孔。附睾头上皮细胞经1,25(OH)_(2)D_(3)处理以及VDR基因敲除后,分别用qRT-PCR检测VDR和17种β防御素基因的表达,用Western blot检测VDR蛋白和3种β防御素蛋白的表达。结果表明,1,25(OH)_(2)D_(3)能极显著提高VDR、gBD124、gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P<0.01),同时极显著提高gBD104、gBD 109tr1、gBD 109tr2、gBD113、gBD116、gBD120、gBD 121以及gBD 123基因的表达(P<0.01),显著提高gBD106、gBD127、gBD 129以及gBD 134基因的表达(P<0.05),而对gBD 110like和gBD 128基因没有显著影响(P>0.05);3个基因敲除载体进行细胞转染后,pCas9-VDR-V1组VDR蛋白表达极显著降低(P<0.01)。VDR基因敲除极显著降低gBD124的mRNA和蛋白表达(P<0.01),显著降低gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P<0.05),同时VDR基因敲除组gBD 109tr1、gBD 109tr2、gBD116、gBD123、gBD127、gBD 128以及gBD 134基因的表达极显著低于其他组(P<0.01),VDR基因敲除组gBD104、gBD106、gBD 120以及gBD 129基因的表达显著低于其他组(P<0.05),而对gBD121、gBD 110like以及gBD 113的相对表达则无显著影响(P>0.05)。综上所述,1,25(OH)_(2)D_(3)可以上调VDR和部分β防御素表达;VDR基因敲除后降低部分β防御素表达,结果表明1,25(OH)_(2)D_(3)通过上调VD/VDR信号通路关键基因VDR的表达调控山羊附睾头上皮细胞部分β防御素表达。

首次从湖南猪源大肠杆菌中检出mcr-1阳性IncI2(Delta)质粒

近年来,由于抗生素耐药基因的广泛传播及多重耐药细菌的出现,导致抗生素的使用面临严峻挑战,致使毒性较强的多黏菌素又重新引起业界的重视,为此对多黏菌素耐药情况的研究也变得十分重要。为了调查畜牧场中多黏菌素耐药基因mcr-1的流行情况,本研究选择我国湖南省某猪场240份肠肛拭子样品,培养分离鉴定出含有mcr-1耐药基因的大肠杆菌菌株,选取多黏菌素等10种抗菌药物对分离的菌株进行耐药性试验,对所有含mcr-1耐药基因的大肠杆菌阳性株进行全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS),采用多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)技术进行大肠杆菌的遗传多样性分析。研究结果表明,在分离出的172株大肠杆菌中,来自不同个体的9株携带mcr-1基因的大肠杆菌均表现出多重耐药现象;MLST分析共鉴定出ST10、ST196、ST46和ST5229共4种分型和4种血清型(O83:H5,O16:H7,O16:H51,O9:H4)。生物信息学分析显示,所有阳性菌株均未发现与mcr-1基因传播有关的典型可移动遗传元件ISApl1,但均检出可能会导致mcr-1传播的IV型分泌系统基因。质粒接合转移试验与单倍型的MLST多态性结果表明,mcr-1基因主要以质粒介导的水平传播为主。本研究是国际上首次在猪源细菌中检出常见于人医临床细菌的携带有mcr-1抗性基因的IncI2(Delta)质粒。

pBD-2对热应激致小鼠小肠形态结构损伤及紧密连接蛋白表达的修复作用

为了研究猪β-防御素-2(porcinβ-defensin2,pBD-2)对热应激致小鼠小肠形态结构损伤及紧密连接蛋白表达的修复作用,试验将36只1月龄昆明小鼠随机分为空白对照组、热应激组和热应激+pBD-2组,每组12只。空白对照组和热应激组每天每只小鼠按体重10μL/g以灌胃的方式给予生理盐水,热应激+pBD-2组每天每只小鼠按体重0.01μg/g以灌胃的方式给予pBD-2。灌胃后将热应激组和热应激+pBD-2组放入40℃温箱热应激处理1 h,取出后与空白对照组一起放置于室温下进行饲养。按照相同的方式共处理28 d,并于第28天处理后断颈处死。每天灌胃前观察各组的行为,记录采食量并称重,试验结束后计算各组平均日采食量和平均日增重,并对小鼠进行剖检,分别取十二指肠、空肠、回肠组织进行石蜡切片制作和H.E.染色,比较各组肠绒毛高度与隐窝深度比值和单位面积内杯状细胞数目,并采用免疫组织化学技术对紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3和Occludin进行检测与相对表达量分析。结果表明:试验期间,空白对照组无异样行为;热应激组探索行为增加,焦虑好动;热应激+pBD-2组比热应激组安静。热应激组平均日采食量显著高于热应激+pBD-2组和空白对照组(P<0.05),而热应激+pBD-2组和空白对照组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组和热应激+pBD-2组平均日增重显著高于热应激组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组平均日增重差异不显著(P>0.05)。空白对照组肠道健康、无红肿,肠道内容物适中;热应激组肠道表面充血、红肿,肠道内容物较多;热应激+pBD-2组肠道无红肿现象,肠道内容物较少。热应激组十二指肠、空肠、回肠绒毛高度与隐窝深度比值均显著低于空白对照组和热应激+pBD-2组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。热应激+pBD-2组十二指肠和空肠单位面积内杯状细胞数量显著高于空白对照组和热应激组(P<0.05),空白对照组显著高于热应激组(P<0.05);热应激+pBD-2组回肠单位面积内杯状细胞数量显著高于热应激组(P<0.05)且与空白对照组间差异不显著(P>0.05),热应激组与空白对照组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组和热应激+pBD-2组十二指肠、空肠和回肠中ZO-1蛋白的相对表达量显著高于热应激组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组十二指肠和空肠中Claudin-3蛋白的相对表达量显著高于热应激组和热应激+pBD-2组(P<0.05),热应激+pBD-2组显著高于热应激组(P<0.05);各组回肠中Claudin-3蛋白的相对表达量差异不显著(P>0.05)。空白对照组十二指肠中Occludin蛋白的相对表达量显著高于热应激组,但热应激+pBD-2组与空白对照组、热应激组均差异不显著(P>0.05);空白对照组和热应激+pBD-2组空肠和回肠中Occludin蛋白的相对表达量显著高于热应激组(P<0.05),但空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。说明热应激处理会影响小鼠的消化吸收功能和小肠形态结构,降低小鼠小肠中紧密连接蛋白的表达量,而pBD-2对热应激造成的上述影响具有较好的修复作用。

猪β防御素2胁迫下大肠杆菌内参基因的稳定性分析

以大肠杆菌的6个管家基因(recA,aspC,ldh,gapdh,mdh,16S rRNA)作为候选的内参基因,大肠杆菌在不同浓度猪β防御素2(0、37.5、75、150 mg·L-1)的胁迫下培养不同时间(1 h和4 h)后,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术比较这6个内参基因表达的稳定性,并通过GeNorm软件分析。结果表明,大肠杆菌中recA基因表达最稳定,其次是aspC和gapdh。并且16S rRNA的相对表达量最高,而ldh的表达量最低。

猪β-防御素-2转化酿酒酵母方法的比较分析

为了建立操作简单、高效率的猪β-防御素-2转化酿酒酵母的方法,试验比较了酿酒酵母的两种转化方法,即电转化和醋酸锂法。结果显示,两种转化方法对细胞生长状态均有严格的要求。在醋酸锂转化中,以培养10h,D600nm为1.051的细胞制备感受态,热激时间为60min时,转化率为136个/μg DNA;在电转化中,以培养12h,D600nm为1.359的细胞制备感受态,电击电压2.5kV时转化效率为154个/μg DNA。但综合操作效率,最终选择醋酸锂法进行酿酒酵母的转化。

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。

基于“肠道菌群调控β-防御素2”探究败酱草对IBD肠纤维化大鼠的作用机制

目的:探究败酱草提取物通过肠道菌群变化调控β-防御素2对炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)肠纤维化的治疗作用及可能机制。方法:选取36只雄性SD大鼠随机分为6组,分别为正常对照组(Normal)、模型组(Model)、柳氮磺胺吡啶阳性对照组(SASP)、败酱草高(PS-H,3.2 g·kg-1)、中(PS-M,2.2 g·kg-1)、低剂量组(PS-L,1.1 g·kg-1),除Normal组给予等体积生理盐水灌肠外,其他各组大鼠均给予2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)的50%乙醇溶液灌肠以诱导炎症性肠病肠纤维化发生。造模后次日起连续灌胃给药7 d, 1次·d-1,Normal组和Model组给予等体积生理盐水。观察大鼠一般行为情况;革兰氏染色观察肠道粪便菌群的变化;HE染色检测结肠组织病理学改变;Masson染色观察结肠组织纤维化情况;免疫组化检测结肠组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)蛋白表达,ELISA法检测结肠组织中β-防御素2、白细胞介素-13(interleukin-13)的表达。结果:与Normal组相比,Model组大鼠结肠病理损伤严重,胶原纤维蓝染增多,提示肠纤维化模型成功。与Model组相比,PS给药组能显著改善IBD肠纤维化大鼠的病理损伤及纤维化程度,下调α-SMA,TGF-β蛋白的异常高表达(P<0.05),降低β-防御素2的表达水平(P<0.05),升高IL-13表达水平(P<0.05),改善肠道菌群紊乱现象。结论:败酱草可能通过调节肠道菌群降低β-防御素2表达进而缓解IBD肠纤维化的疾病进程。

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。

猪β防御素-2对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内外抑菌活性研究

本研究旨在评价猪β防御素2(porcine beta defensin 2,PBD-2)在体内外对猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的抗菌效果,为评估PBD-2在抗生素替代品中的应用前景提供参考。首先,在体外检测不同浓度PBD-2对猪源ExPEC PCN033的杀菌活性。随后,选取5周龄,体重在18~22 g之间的雌性昆明小鼠,检测PBD-2处理组和PBS对照组小鼠(n≥5)感染不同剂量的ExPEC PCN033后的存活率,脑、脾脏、肺脏组织和血液中的载菌量、炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平及脑、脾脏、肺脏组织的病理变化程度。结果表明,PBD-2在25μg/mL时即可在体外极显著抑制猪源ExPEC PCN033的生长(P<0.01),且抑制作用随PBD-2的浓度升高而增强。在体内,与PBS对照组相比,PBD-2处理有效降低了小鼠感染不同剂量ExPEC PCN033后的死亡率。提高PBD-2的治疗剂量对降低小鼠死亡率的效果更加明显。腹腔注射和肌内注射的方式在PBD-2降低小鼠死亡率的效果方面优于口服途径。PBD-2治疗在降低小鼠死亡率的效果方面略低于氯霉素治疗。同时,PBD-2治疗极显著降低了小鼠感染ExPEC PCN03321 h后的脑、脾脏、肺脏组织和血液中的细菌载量(P<0.01),降低了血液中的IL-6、IL-12和IL-1β的含量(P<0.01),减轻了脑、脾脏和肺脏组织的病变程度。上述结果说明PBD-2在体外具有良好的抗猪源ExPEC的活性,同时在小鼠体内对猪源ExPEC感染具有治疗作用,表明PBD-2具有开发成为治疗性药物或者抗生素替代品的潜力。

藏猪β-防御素2基因克隆及原核表达载体的构建

为了构建藏猪β-防御素2(pBD-2)成熟肽原核表达载体,从藏猪肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR获取pBD-2目的基因,并与pMD19-T载体连接构建重组质粒,命名为pMD19T-pBD-2;以pMD19T-pBD-2质粒为模板,克隆pBD-2成熟肽c DNA序列并构建成熟肽p ET-32a-pBD-2表达质粒。结果显示,藏猪pBD-2基因全长为298bp,与野猪和家猪的pBD-2基因同源性分别达100.0%和98.9%;藏猪pBD-2基因具有1个完整的开放阅读框,编码69个氨基酸组成的多肽,包含21个氨基酸残基的信号肽、11个氨基酸残基的前导肽和37个氨基酸残基的成熟肽;编码的pBD-2成熟肽稳定性较好,分子量4 085.78,等电点8.89,具有6个半胱氨酸(Cys)残基,7个带正电荷和2个带负电荷的氨基酸残基,为亲脂性和亲水性多肽;从pMD19T-pBD-2质粒中亚克隆得到长度为114 bp藏猪pBD-2成熟肽c DNA序列,菌落PCR、酶切和测序鉴定证明成功构建了成熟肽pET-32a-pBD-2原核表达质粒。