永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

ACE2对猪流行性腹泻病毒体外感染传代猪小肠上皮细胞的影响

为探究血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染仔猪过程中发挥的作用,本研究通过转录组学分析仔猪肠道ACE2在PEDV感染前后表达的变化情况,然后利用猪小肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cells, IPEC-J2细胞)模型,通过RT-qPCR、Western blot检测PEDV感染后ACE2的mRNA、蛋白表达水平的变化。过表达与抑制表达ACE2后通过RT-qPCR、Western blot、TCID50检测PEDV复制水平。结果显示,PEDV感染IPEC-J2后ACE2的mRNA及蛋白表达水平均显著下调,与转录组学结果一致。过表达ACE2组PEDV感染量显著上升,抑制表达ACE2组PEDV感染量显著下降。本研究在细胞水平上验证了ACE2在PEDV感染过程中的作用,即PEDV感染能够使ACE2表达量下降,在IPEC-J2细胞中过表达ACE2能提高PEDV复制水平,抑制ACE2的表达可降低PEDV复制水平。

干扰SOCS1基因表达对猪乳腺上皮细胞凋亡的调控效应

细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)是一种调节细胞内信号通路活性的负调控因子,参与调控机体细胞的多种生理功能。为探索SOCS1基因沉默对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响,试验通过构建猪SOCS1基因shRNA干扰载体,转染猪乳腺上皮细胞,TMT定量蛋白组学筛选差异蛋白,Annexin V/PI、CCK-8和流式细胞术检测细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡。结果显示,干扰组(shRNA-SOCS1-138)与空白组相比,共筛选到差异表达蛋白52个,其中上调蛋白26个,下调蛋白26个。GO富集发现,差异蛋白主要富集在病毒防御响应、EB病毒遗传缺陷反应后的免疫缺陷和对其他生物的免疫反应几个方面。KEGG通路富集发现,差异蛋白主要富集在坏死性凋亡、丙型肝炎和全身性红斑狼疮信号通路。干扰SOCS1后,乳腺上皮细胞450 nm的OD值在12、24、48 h和72 h的细胞量显著或极显著高于空白组;G1期和G2期细胞占比均极显著高于空白组,S期细胞百分比极显著低于空白组;干扰组与空白组之间细胞凋亡率差异达到显著水平。综合研究结果揭示,SOCS1基因沉默可促进细胞增殖和降低细胞的凋亡,引起G1/S期阻滞,并受多个信号通路的调控作用。

ROS积聚在黄曲霉毒素B_(1)诱导仔猪空肠上皮细胞凋亡中的作用

【目的】探究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))诱导细胞内活性氧(ROS)的产生对猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)凋亡的影响,为AFB_(1)致病机制提供理论依据。【方法】用0、20、40、60、80和100μg/mL AFB_(1)刺激细胞12 h,使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,以确定AFB_(1)对IPEC-J2细胞的毒性作用;使用0、10、20、30μg/mL AFB_(1)刺激细胞后采用ROS免疫荧光分析法检测细胞内ROS产生情况;使用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测细胞内凋亡通路相关的关键因子mRNA和蛋白表达情况,并采用ROS抑制剂N-乙酰-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)处理细胞后检测AFB_(1)对细胞内凋亡因子表达的影响情况。【结果】0~20μg/mL AFB_(1)对细胞活性无显著影响(P>0.05),但随着AFB_(1)浓度升高,与空白对照组相比,IPEC-J2细胞活性显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01)。ROS免疫荧光分析结果显示,ROS含量与AFB_(1)浓度呈高度依赖性,且随着AFB_(1)浓度的升高,与空白对照组相比,细胞内ROS含量显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01)。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,当AFB_(1)浓度为20μg/mL时Caspase-3 mRNA和蛋白表达量均显著高于空白对照组(P<0.05);当AFB_(1)浓度为30μg/mL时Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA和蛋白表达量显著高于空白对照组(P<0.05),而Bax和Bcl-2蛋白表达量显著低于空白对照组(P<0.05);与AFB_(1)单独处理组相比,使用ROS抑制剂NAC预处理细胞后加入AFB_(1),凋亡因子呈现出不同程度的显著下降趋势(P<0.05)。【结论】AFB_(1)可促进IPEC-J2细胞凋亡因子Bax、Bcl-2和Caspase-3的上调,并且这一过程与细胞内ROS的积累有关。

乳酸锌对猪空肠上皮细胞IPEC-J2增殖及相关调控基因mRNA表达的影响

旨在探讨乳酸锌对猪空肠上皮细胞增殖及相关调控基因ZnT2、DMT1、IREG-1、MT1和ZIP4mRNA表达的影响。用乳酸锌的锌浓度分别为50、100、150、200mg.L-1的培养基培养IPEC-J2细胞,采用比色法测定分析细胞增殖变化;用实时荧光定量RT-PCR方法检测ZnT2、DMT1、IREG-1、MT1及ZIP4mRNA表达,以TBPmRNA的表达水平作为内参对照。在细胞培养前36h,乳酸锌对IPEC-J2细胞基本没有影响,随锌浓度递增细胞增殖幅度升高;乳酸锌处理IPEC-J2细胞后,ZnT2、DMT1、IREG-1及MT1mRNA表达随锌浓度增高而升高,ZIP4mRNA表达则随锌浓度增高而降低。添加乳酸锌可以促进IPEC-J2细胞增殖,上调ZnT2、DMT1、IREG-1、MT1mRNA表达,下调ZIP4mRNA表达。

猪小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块培养法能够成功培养猪小肠上皮细胞并稳定传11代。2)本试验获得的猪小肠上皮细胞角蛋白18抗原鉴定为阳性,染色体核型为二倍体。3)倒置显微镜下观察培养至第11代的猪小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,呈现"铺路石"和上皮样形态。培养11代后的猪小肠上皮细胞间隙开始变大,规则不明显,细胞开始凋亡。第15代的猪小肠上皮细胞则出现大量凋亡并从瓶底脱落,仅有很少细胞贴壁生长。综上所述,采用组织块培养法能够获得生物学功能稳定的猪小肠上皮细胞系并能正常传11代,可为细胞的永生化提供试验素材。

营养、大肠杆菌和氨基酸对猪小肠上皮细胞抗菌肽和信号通路蛋白表达的影响

为了研究应激和氨基酸对上皮抗菌肽表达的作用和分子机制,试验选用猪小肠上皮细胞系IPEC-J2作为研究对象,饥饿和大肠杆菌感染分别作为营养应激和细菌应激,丙氨酸和异亮氨酸作为氨基酸处理,收集细胞mRNA,利用荧光定量PCR测定β防御素和相关信号通路蛋白表达水平。结果表明:与对照组(DMEM/F12培养基)相比,饥饿显著降低了小肠上皮细胞猪防御素2(p BD-2)、猪防御素3(p BD-3)和猪防御素EP2c(p EP2c)及沉默信息调节因子2同源蛋白1(Sirt1)、叉头转录因子1(Fox O1)和叉头转录因子4(Fox O4)的表达(P<0.05),大肠杆菌对β防御素表达无显著影响(P>0.05)。与对照组(饥饿培养基)相比,丙氨酸处理未显著影响p BD-2和p BD-3的表达(P>0.05),但显著提高了p EP2c表达水平(P<0.05);异亮氨酸处理使p BD-2、p BD-3和p EP2c表达水平显著升高(P<0.05)。与对照组相比,丙氨酸和异亮氨酸处理不同程度影响信号通路蛋白转录,丙氨酸处理显著提高了Sirt1和Fox O4的表达水平(P<0.05),异亮氨酸处理显著促进了Sirt1、Fox O1和Fox O4的表达(P<0.05)。由此得出,营养应激降低猪小肠上皮细胞中β防御素的表达,而氨基酸的补充可促进其表达,该调控作用可能与Sirt1和叉头转录因子(Fox O)信号通路蛋白有关。

壳寡糖对脂多糖诱导猪空肠上皮细胞氧化损伤的作用

本试验旨在通过脂多糖(LPS)诱导猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)来建立氧化应激模型,探讨壳寡糖(COS)的抗氧化作用效果。采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS和COS对IPEC-J2作用12、24、48 h后细胞增殖活性的变化;选择适宜浓度LPS(1.0μg/m L)和COS(200μg/m L)作用于IPEC-J2,分为对照组、LPS组、COS组、LPS+COS组。采用Western Blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)的含量。结果表明:1.0μg/m L的LPS对IPEC-J2作用24 h,细胞增殖的抑制率为41.6%,为造模的最适浓度和作用时间;COS在一定浓度范围内对IPEC-J2有增殖作用,其浓度为200μg/m L时效果最佳,作用时间为24 h时,细胞增殖率达到126.3%。LPS+COS组较对照组的SOD、CAT活性和M DA含量差异不显著(P>0.05),Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);LPS+COS组较LPS组的Nrf2蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),HO-1有升高趋势,但差异不显著(P>0.05),SOD、CAT活性显著升高(P<0.05),M DA含量显著降低(P<0.05)。由此可见,LPS诱导IPEC-J2氧化应激,而COS可进一步促进Nrf2和HO-1蛋白的高表达,并提高抗氧化酶的活性,降低氧化产物含量,从而增强细胞对氧化应激的抵抗力,起到保护作用。

丁酸梭菌对产肠毒素大肠杆菌刺激猪肠道上皮细胞炎症反应的抑制效果

本试验旨在通过丁酸梭菌(CB)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和猪肠道上皮细胞(IPEC-J2细胞)共培养细胞模型,探讨CB对ETEC产黏附基因、产肠毒素基因以及ETEC刺激IPEC-J2细胞炎症相关因子表达的影响。试验设5组,分别为对照组、ETEC组、ETEC+CB 106组、ETEC+CB 107组、ETEC+CB 108组。ETEC组在IPEC-J2细胞培养液中加入1×108CFU/mL的ETEC,ETEC+CB 106组、ETEC+CB 107组、ETEC+CB 108组在IPEC-J2细胞培养液中加入1×108CFU/mL ETEC的同时分别加入1×106、1×107和1×108CFU/mL CB,对照组IPEC-J2细胞培养液中不添加ETEC和CB,37℃培养2 h后用显微镜观察细胞形态并收集细胞。采用实时定量PCR分析ETEC产黏附基因FaeG与肠毒素基因estA、estB及IPEC-J2细胞中促炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8与抗炎性因子IL-10 mRNA的相对表达水平。结果显示:CB可有效抑制ETEC诱导的IPEC-J2细胞损伤脱落。与ETEC组对比,不同浓度CB干预后显著抑制了ETEC产黏附基因FaeG与肠毒素基因estA、estB的表达(P<0.05),且CB浓度为1×108CFU/mL时效果最明显。与对照组相比,ETEC组IPEC-J2细胞中促炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的相对表达水平显著升高(P<0.05),抗炎性因子IL-10 mRNA的相对表达水平显著降低(P<0.05)。而添加不同浓度CB干预后,IPEC-J2细胞中IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的相对表达水平较ETEC组显著降低(P<0.05),IL-10 mRNA的相对表达水平则较ETEC组显著升高(P<0.05),其中CB浓度为1×108CFU/mL时对IL-1β、IL-6和IL-8表达的抑制效果最强,浓度为1×107CFU/mL时对IL-2表达的抑制效果最强。以上结果表明,CB可降低ETEC黏附基因和产肠毒素基因表达,抑制ETEC诱导的猪肠道上皮细胞的炎症反应,降低ETEC对猪肠道上皮细胞的损伤作用。

苏氨酸对体外培养感染伪狂犬病毒猪空肠上皮细胞免疫相关基因表达的影响

本研究旨在探讨苏氨酸对体外培养感染伪狂犬病毒(PRV)猪空肠上皮细胞免疫相关基因表达的影响。试验选用IPEC-J2细胞为细胞模型,分为4个处理,对照组为未经PRV感染、苏氨酸浓度53.45 mg/L,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,均经PRV感染,苏氨酸浓度分别为53.45、106.90、160.35 mg/L,每组3个重复,每个重复4孔。37℃、5%CO2培养后1、6、12、24 h每组取1个重复采集细胞,用实时荧光定量PCR方法检测白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素15(IL-15)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA表达量。结果表明:1)PRV感染极显著降低了IL-1βmRNA表达量(P=0.001),苏氨酸水平(P=0.830)、时间与苏氨酸水平交互作用(P=0.249)的影响均不显著;2)PRV感染对IL-6 mRNA表达量影响不显著(P=0.162),随苏氨酸水平升高,IL-6 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.002),时间与苏氨酸水平交互作用的影响显著(P=0.012);3)PRV感染极显著提高了IL-15 mRNA表达量(P=0.000),提高苏氨酸水平极显著提高了IL-15 mRNA表达量(P=0.000),时间与苏氨酸水平交互作用的影响亦极显著(P=0.000);4)PRV感染极显著提高了TNF-αmRNA表达量(P=0.000),苏氨酸水平(P=0.113)、时间与苏氨酸水平交互作用(P=0.195)的影响均不显著;5)PRV感染极显著提高了TGF-β1 mRNA表达量(P=0.000),时间与苏氨酸水平交互作用的影响显著(P=0.015),苏氨酸水平的影响不显著(P=0.055)。结果提示,补充苏氨酸对感染PRV的IPEC-J2细胞先天性免疫功能具有分子表达水平的调控作用,总体上能够抑制IL-1β、TNF-α、TGF-β1基因表达,加强IL-6、IL-15基因表达,但影响具有时间效应。

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,提取了IECs的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,进行选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定。结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×10~8 pfu/mL,插入cDNA片段长度为250～2500 bp,文库阳性率达100%。本研究结果表明构建的IECs-cDNA文库具有较好的多态性,为后续研究PEDV与宿主细胞蛋白之间的互作关系提供了有力支持。

猪源粪肠球菌对猪小肠上皮细胞黏附及致炎作用的影响

【目的】通过研究猪源粪肠球菌对肠上皮细胞黏附与致炎作用的影响,探究其致病机制。【方法】利用自行分离鉴定的猪源粪肠球菌N41菌株和N8菌株,通过吉姆萨染色、革兰氏染色、间接免疫荧光检测和场发射扫描电子显微镜观察等手段观察猪源粪肠球菌体外黏附猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells,IPEC-J2),应用荧光定量PCR方法检测IPEC-J2炎性细胞因子转录水平的变化,以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物包括上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)、蜗形蛋白(snail)和波形蛋白(vimen)的转录水平变化。【结果】吉姆萨染色和革兰氏染色镜检结果发现,粪肠球菌能黏附于IPEC-J2,黏附部位位于细胞表面及细胞间紧密连接处,出现聚集现象,呈现不均匀性;携带相同主要毒力基因的粪肠球菌(粪肠球菌N8菌株、粪肠球菌N41菌株)在体外对IPEC-J2的黏附存在差异。荧光定量PCR检测结果显示,感染粪肠球菌后,IPEC-J2中的促炎因子白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6和IL-8的表达呈现出相似的炎症反应规律,总体趋势为感染后1~4 h炎症反应水平随时间而升高,4~6 h炎症反应降低但仍高于空白对照组细胞。同时,粪肠球菌感染下调了抗炎因子转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)和IL-12的转录水平,以IL-12的下降最显著。此外,不同菌株对于上述细胞因子水平的调节有一定差异,其中N41菌株对促炎因子的上调能力高于N8菌株,而N8菌株对抗炎因子的下调幅度高于N41菌株。EMT标志物检测结果表明,与致病菌肠出血性大肠杆菌O157∶H7相比,猪源粪肠球菌感染IPEC-J2后对EMT标志物的表达水平影响并不明显。【结论】证实了猪源粪肠球菌对IPEC的体外侵袭能力,同时该菌会引起炎性细胞因子的表达升高。

表皮生长因子调控猪肠上皮细胞中钠依赖Ⅱb型磷转运蛋白表达的细胞信号通路研究

本研究旨在探讨表皮生长因子(EGF)调控猪小肠上皮细胞IPEC-J2中钠依赖Ⅱb型磷转运蛋白(NaPi-Ⅱb)表达的分子机制。试验分别用EGF受体酪氨酸激酶抑制剂(tyrphostin AG1478)、蛋白激酶A(PKA)抑制剂(H89)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂(k4393)、p38抑制剂(SB203580)、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂(PD98059)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂(anisomycin)与EGF共同处理IPEC-J2细胞,利用Western blot检测相关通路蛋白及目的蛋白(NaPi-Ⅱb)的表达水平。结果显示:相较于对照组,EGF处理后NaPi-Ⅱb表达水平显著降低(P<0.05);相较于无抑制剂组,EGF受体、PKA、PKC、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p38、MAPK/ERK1/2、MAPK/JNK的特异性抑制剂处理IPEC-J2后,NaPi-Ⅱb表达水平显著提高(P<0.05),其中添加MAPK/ERK1/2特异性抑制剂显著降低了MAPK/ERK1/2在Tyr204位点的磷酸化水平(P<0.05),添加MAPK/JNK的特异性抑制剂显著降低了MAPK/JNK1/2/3在Thr183和Tyr185位点的磷酸化水平(P<0.05),说明该2组抑制剂对该通路的抑制作用是通过降低上述位点的磷酸化水平实现的。本研究结果表明EGF受体、PKA、PKC、p38、ERK和JNK均介导了EGF调控IPEC-J2细胞中NaPi-Ⅱb的表达。

猪小肠黏膜上皮细胞原代培养

分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。

基于永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02对猪源益生性乳酸菌的筛选

【目的】从健康仔猪的粪便及各肠段内容物和黏液中分离乳酸菌,并以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02为体外细胞模型对猪源益生性乳酸菌进行筛选。【方法】采用分离培养和常规生化试验对乳酸菌进行分离与鉴定。用永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02作为体外模型,通过黏附性试验、耐酸耐胆盐试验和对致病菌的黏附抑制试验对菌株进行筛选。【结果】分离筛选出了12株乳酸菌,其黏附能力存在差异。Y091231、Y091221、Y224031、X302032、Y223052和Y223072等6株菌的黏附性较好,黏附指数依次为:2 903.25±83.33,2 320.37±81.02,1 965.43±37.72,1 416.12±62.74,1 100.00±68.10,988.73±17.06。对其进行耐酸耐胆盐试验和抑菌试验,结果表明,菌株Y091231、Y091221和Y224031对致病菌均具有较强的黏附抑制能力,且对高胆盐、低pH具有较强的耐受性。其中Y091231对大肠杆菌C83921的黏附抑制率可达(99.40±3.17)%,Y091221对致病性沙门氏菌的黏附抑制率为(97.10±2.04)%,Y091231对金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑制率为(98.00±2.31)%。Y091231、Y091221和Y224031 3株菌分别被鉴定为发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌。【结论】筛选得到的3株益生性乳酸菌,不仅具有耐酸耐胆盐能力,而且对小肠黏膜上皮细胞具有强黏附性,对大肠杆菌C83921、致病性沙门氏菌和金黄色葡萄球菌CVCC2258具有较强的黏附抑制能力,可作为肠道微生态制剂的候选菌株。

GSK3在人、鼠、猪的肺组织及培养的猪支气管上皮细胞中的表达

目的探讨GSK3在动物肺组织及培养的猪支气管上皮细胞中的表达。方法用免疫组化,免疫细胞荧光法检测GSK3在人、大鼠、小鼠和猪的肺组织及培养的猪支气管上皮细胞中的表达。结果GSK3α和β广泛表达于人、鼠和猪的肺组织中,定位于胞浆。它们在几种动物肺组织中的表达分布大致相似,主要见于各级支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、粘膜平滑肌细胞和粘膜下腺体。但GSK3α在软骨细胞中表达明显强于GSK3β;几种哺乳动物肺组织中均未检测到GSK3的磷酸化。免疫荧光检测培养的猪支气管上皮细胞中有丰富的GSK3α、β的表达,磷酸化的GSK3信号弱。结论GSK3α、β丰富表达于不同种属哺乳动物肺组织的支气管上皮、腺体以及肺泡上皮,提示其可能在肺组织的生理功能和病理发生机制中起着重要作用。

不同培养条件对乳酸菌黏附猪小肠黏膜上皮细胞的影响

为了研究不同培养条件对乳酸菌黏附猪小肠黏膜上皮细胞的影响,试验采用体外细胞培养方法,观察乳酸杆菌在不同条件下（如pH值、温度、离子浓度）黏附猪小肠黏膜上皮细胞的能力。结果表明：p H值为6时,小肠黏膜上皮细胞黏附乳酸杆菌数为（15.60±0.58）个,较其他pH值时多;与其他温度（30℃和42℃）相比,37℃时猪小肠黏膜上皮细胞黏附乳酸杆菌数最多,为（22.44±1.05）个/细胞;与其他浓度相比较,猪小肠黏膜上皮细胞黏附乳酸杆菌数最多的是,2 mmol/L Ca^2＋时为（11.36±2.36）个/细胞,2 mmol/L Mg^2＋时为（18.75±1.37）个/细胞,0.005 mmol/L Fe^2＋时为（22.48±2.78）个/细胞,0.000 5 mmol/L Cu^2＋时为（20.24±2.35）个/细胞,0.0025 mmol/L Zn2＋时为（17.48±1.59）个/细胞;不同浓度的S2-对乳酸杆菌黏附小肠黏膜上皮细胞黏附性影响不显著;0.005 mmol/L I-时小肠黏膜上皮细胞黏附细菌数为（19.68±1.25）个/细胞,其他浓度I-对乳酸杆菌的细胞黏附性影响不显著。说明乳酸杆菌与猪小肠黏膜上皮细胞黏附的最佳酸碱度、温度分别为pH值为6-7、37-42℃;Ca^2＋、Mg^2＋、Fe^2＋、Cu^2＋、Zn^2＋、I^-等6种离子的最适浓度分别为2,2,0.005,0.000 5,0.002 5,0.005 mmol/L。

猪圆环病毒2型在猪气管上皮细胞中的增殖研究

为了研究猪圆环病毒2型（PCV-2）在猪气管上皮细胞（STECs）中的增殖情况,试验先分离原代猪气管上皮细胞,鉴定纯化后感染PCV-2并传至第3代,显微镜下观察未发现细胞病毒效应。培养24-48 h后收集接毒的猪气管上皮细胞,裂解细胞后进行PCR鉴定、测序及IPMA检测。结果表明：PCR扩增获得的病毒全基组片段大小为1 767 bp;全基因序列同源性比对发现,分离株与加拿大毒株（DQ200735）同源性达99.9%;IPMA测定病毒的TCID50为1×10^-4.75/mL。说明PCV-2可以在猪气管上皮细胞中稳定增殖,且效价达到一定水平。

副猪嗜血杆菌对猪肺泡上皮细胞氧化应激及细胞因子分泌的影响

为了研究副猪嗜血杆菌对猪肺泡上皮细胞氧化应激及细胞因子分泌的影响,试验采用CCK-8分析副猪嗜血杆菌HS1075与猪肺泡上皮细胞SJPL共孵育后细胞活力,利用ELISA试剂盒检测细胞GSH-Px、i NOS、MDA、NO、ROS、SOD和T-AOC变化,利用荧光酶标仪观察细胞ROS水平,利用LDH试剂盒检测细胞LDH水平;并用ELISA试剂盒检测细胞IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和TGF-β水平。结果表明:随着孵育时间延长,导致i NOS、MDA、NO和ROS氧化水平以及LDH水平逐渐升高,而GSH-Px、SOD和T-AOC抗氧化水平逐渐降低;猪肺泡上皮细胞分泌的IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α水平逐渐升高,而IL-4、IL-10和TGF-β逐渐降低。说明副猪嗜血杆菌可诱导猪肺泡上皮细胞发生氧化损伤,影响细胞因子分泌。