猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因的序列,分别设计相应的引物,构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品,通过优化反应条件和反应程序,建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法具有较高的灵敏性,对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10^(2),1.44×10^(2),1.51×10^(2)和1.56×10^(2)拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪瘟病毒(swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus-2)PCV-2、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV),结果均呈阴性,具有良好的特异性。重复性试验结果显示,在同等条件下扩增4种病毒的阳性质粒,3次均出现同样的目的条带。应用建立的方法检测了采集的48份腹泻猪的小肠组织和粪便样品,结果检测出2份PSV、7份PDCoV和11份PEDV,与单重RT-PCR检测结果的总符合率为91.66%。同时发现2份PSV和PDCoV混合感染,3份PEDV和PDCoV混合感染,2种检测方法对混合感染检测结果相一致。对2份阳性样品的PCR产物进行测序,结果与检测结果相符合。本试验建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,为临床检测PSV、PDCoV、TGEV、PEDV和流行病学调查提供了便捷有效的方法。