新疆维吾尔自治区阿拉尔市某规模化养殖场猪乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及其毒力、耐药性分析

[目的]分离鉴定新疆维吾尔自治区阿拉尔市猪乳源金黄色葡萄球菌,了解其致病性和耐药性。[方法]从阿拉尔市某规模化养殖场收集6份新鲜猪乳样本,采用甘露醇高盐琼脂(MSA)培养基分离乳样中的金黄色葡萄球菌,利用表型鉴定方法及细菌16S rDNA序列分析法对分离到的菌株进行鉴定,检测分离菌株的生物被膜形成能力,利用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验,利用PCR法检测毒力基因和耐药基因。[结果]经分离培养及分子生物学鉴定,从6份乳样中获得2株金黄色葡萄球菌,分离率为33.33%(2/6);2株金黄色葡萄球菌均具有强生物被膜形成能力(+++);2株金黄色葡萄球菌均对利福平敏感,均对青霉素、头孢西丁、四环素、红霉素、替米考星、克林霉素和磺胺甲噁唑耐药;在检测的5种耐药基因中,2株金黄色葡萄球菌均携带ant(4)基因和mecA基因;在检测的20种毒力基因中,共检测到6种毒力基因,其中,2株金黄色葡萄球菌均携带seg、sei、hlb、fnbA、clfA基因,有1株携带hla基因。[结论]该养殖场猪乳源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力强,携带多种毒力基因和耐药基因,表现为多重耐药性。

猪乳外泌体中miRNA对猪繁殖与呼吸综合征的防御作用

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)现在已经影响到全世界的养猪产业,危害整个产业链的经济效益。一些miRNA在抵御病毒方面具有不错的效果,已成为目前病毒和分子领域的热点之一。猪乳外泌体中也存在miRNA,且具有防御猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,但目前该方向的研究尚无较大成果的突破,具有广阔的研究前景。文章论述了PRRSV的致病机制及防治研究进展,总结了外泌体中miRNA的作用机制及对PRRSV的作用,为后续猪乳外泌体分离检测以及筛选出相关miRNA、推进后续PRRS疫苗研发提供参考。

猪乳中一组高分子量蛋白的多态性及其与繁殖性能关系的研究

采用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板电泳 (SDS PAGE)对 16 2头二花脸母猪乳中一组高分子量蛋白质 (HMWP)进行了检测 ,计算了该位点的基因型频率、等位基因频率和遗传多样性指数等 ,并运用线性模型统计方法分析了该位点的不同基因型与母猪繁殖性能的关系。结果表明 ,在二花脸猪种群 ,乳中HMWP存在B(M :11480 0± 40 0 )和D(M :10 140 0± 6 0 0 )两种带 ,分别受二个等位基因HB 和HD 控制。BB、BD和DD三种基因型频率分别为 0 6 6 6 7、0 2 716和 0 0 6 17,两个等位基因HB 和HD 频率分别为 0 80 2 5和 0 1975 ,遗传多样性指数为0 3170。在三种HMWP基因型中 ,不同基因型母猪的繁殖性能在活仔数和窝重上存在着显著差异 (P <0 0 5 ) ,但在初生仔猪个体重和 2 0日龄窝重上未达到显著水平 (P >0 0 5 )。

猪乳中常规成分、胰岛素和表皮生长因子浓度的动态变化

选择 8头 3～ 4胎、产仔 9～ 1 3头的健康大长北 (大约克×长白×北京黑猪 )母猪 ,对其分娩后 35d泌乳期内初乳和常乳中的常规成分、胰岛素和表皮生长因子进行了动态分析。结果表明 ,母猪刚分娩时其初乳中乳蛋白、总固型物、胰岛素和表皮生长因子的浓度均高于常乳 ( P<0 .0 5) ,乳糖和乳脂则随泌乳期延长而增加 ,分娩后 3d内这种变化显著 ( P<0 .0 5) 。

猪乳铁蛋白基因的克隆及其重组乳酸菌表达系统构建

根据猪乳铁蛋白N端基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,以泌乳3日龄母猪乳腺组织RNA为模板,进行RT-PCR,获得含有猪乳铁蛋白基因N端1 077 bp目的片段,将其与表达载体质粒pPG612.1进行连接,通过转化进入宿主菌JM109细胞内,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析,表明猪乳铁蛋白N端PLFN基因已成功插入到表达载体质粒中,获得了猪乳铁蛋白干酪乳杆菌表达载体质粒pPG612-PLFN。将获得的重组质粒再分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、植物乳杆菌KLDS1.0344、副干酪乳杆菌KLDS1.0652及戊糖乳杆菌KLDS1.0413中,获得表达猪乳铁蛋白基因的多种重组乳酸菌分别为pPG612-PLFN/L.casei,pPG612-PLFN/L.plantarum,pPG612-PLFN/L.paracasei和pPG612-PLFN/L.pentosus.,为猪乳铁蛋白的乳酸菌表达及重组乳酸菌抗菌制剂的制备奠定了基础。

表达猪乳铁蛋白的戊糖乳杆菌对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用

为研究猪抗大肠杆菌(E.coli)K88的口服疫苗,本研究构建了表达猪乳铁蛋白的重组戊糖乳杆菌(pPG2-pLF/L.pentosus),并将其连续10 d灌喂小鼠后,采用E.coliK88口服攻毒。攻毒后7d,取小肠样本通过扫描电镜检测,并对盲肠内容物进行菌落分离计数,取血液样本,检测IgG、sIgA、IL-2、IL-4和INF-α指标评价其免疫效果。结果显示:灌服pPG2-p LF/L.pentosus组小鼠肠绒毛高度与健康对照组无显著变化,其IgG、sIgA、IL-2和INF-α水平显著提高;小鼠肠道中E.coli总数显著低于攻毒对照组,而且攻毒后小鼠的死亡率显著降低(p<0.05)。这些数据表明,饲喂pPG2-pLF/L.pentosus可以抵抗E.coli K88对小鼠的致病力,减轻病原菌攻毒对小鼠肠道组织的功能损伤,降低肠道内致病菌数量,提高小鼠免疫机能。

表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪应用效果的研究

本试验以表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌饲喂断奶仔猪,研究其作为生态友好安全型的饲料添加剂替代抗生素的可行性。试验选取体重相近的36头断奶仔猪,分为3组,每组3个重复,每个重复4头。对照组饲喂基础饲粮,抗生素组饲喂添加20 mg/kg黄霉素和110 mg/kg金霉素的基础饲粮,试验组在饲喂基础饲粮的基础上每日按仔猪体重添加1次表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌发酵菌液,每头仔猪每天饲喂乳铁蛋白含量约为50μg/kg。试验期21 d。结果表明:在饲粮中添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌,与对照组相比,平均日增重显著提高(P<0.05),料重比极显著降低(P<0.01);与对照组和抗生素组相比,胸腺指数和脾脏指数均显著提高(P<0.05),盲肠中大肠杆菌数量极显著降低(P<0.01),盲肠中乳酸乳球菌数量极显著提高(P<0.01),十二指肠、空肠的绒毛高度/隐窝深度极显著提高(P<0.01);与对照组相比,血清中免疫球蛋白G、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A含量显著提高(P<0.05),与抗生素组相比未达到显著水平(P>0.05);血清中白细胞介素-1含量显著高于对照组和抗生素组(P<0.05),血清中白细胞介素-2含量极显著高于对照组(P<0.01),显著高于抗生素组(P<0.05)。由此得出,在断奶仔猪饲粮中添加表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌可促进仔猪肠道黏膜绒毛的发育,提高仔猪的饲料利用率,降低料重比,同时增强仔猪免疫功能,具有提高仔猪生长性能的作用。

猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测

为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。

二花脸猪乳中生长因子的动态分析及其与大约克猪的比较

通过 2个系列实验 ,分析了二花脸猪乳中生长因子 (IGF Ⅰ、EGF和胰岛素 )在泌乳早期 (1～ 2 1d)的含量及其变化规律 ,并与大约克猪进行了比较研究。结果表明 ,二花脸和大约克猪乳中IGF Ⅰ在初乳中浓度很高 ,分娩 1周后迅速下降 ,泌乳第 7～ 2 1天变化不大。在泌乳第 1～ 7天 ,二花脸猪乳中IGF Ⅰ低于大约克猪 ,泌乳第 7天以后又高于大约克 ,但 2种猪的差别不显著 (P >0 0 5)。猪乳中的EGF变化规律基本上和IGF Ⅰ相同。在泌乳第 1天 ,二花脸猪乳中的EGF显著低于大约克猪 (P <0 0 5) ,第 1天以后 2种猪没有明显差异。二花脸和大约克猪乳中的胰岛素在初乳很高 ,产后 4d迅速下降 ,4d以后变化幅度不大。二花脸猪乳中的胰岛素在泌乳早期 (1～ 2 1d)全都低于大约克猪 ,其中在泌乳第 1天、第 6～ 7天、第 8～10天和第 11～ 14天这 4个阶段显著低于大约克猪 (P <0 0 5)。

猪乳中一高分子量蛋白质的分离纯化和鉴定(英文)

对猪乳中一高分子量蛋白 (HMWP)进行了分离纯化 ,并对其某些生化性质进行了鉴定。猪乳通过去脂得到脱脂乳 ,再去除酪蛋白得到乳清。对乳清进行硫酸铵分级盐析 ,猪乳中HMWP在 4 0 %饱和度硫酸铵盐析下有最大沉淀。收集 4 0 %饱和度硫酸铵盐析沉淀 ,经过溶解、透析得到HMWP的粗品。通过MonoQ离子交换柱 ,对其粗品进行两次层析提纯 ,得到了HMWP纯品 ,其纯度和得率分别为 97.85 %和 12 .31%。多种植物凝集素的Westernblotting鉴定表明 ,HMWP是一个糖基种类较少的糖蛋白 ,含有Man和GlcNAc。SDS PAGE和凝胶过滤分别测得HMWP的分子量为 114 .8kD和 115 .0kD。通过等电点测定 ,HMWP的pI为 5 .10。HMWP的氨基酸组分分析得知 ,其富含Asp、Glu、Gly和Cys,疏水性氨基酸较低 ,仅占 15 .5 9%摩尔分数。这些结果说明HMWP是一个易溶于水的、酸性的分泌性单体球蛋白。N端氨基酸序列测定结果为Ala Leu Val Gln Ser Gly Leu Asn Leu Val,通过从网络Genbank检索没有发现其同源蛋白的序列 ,说明其可能是一个新蛋白。

猪乳中乳成分变化的曲线拟合

以 10 0头二花脸母猪作为试验动物 ,对猪乳中蛋白质、乳糖、IGF- 、EGF和胰岛素含量在泌乳 1～ 2 1d阶段的变化进行了曲线拟合 ,并分析了这些乳成分的变化规律。结果表明 ,倒数曲线为乳蛋白、IGF- 、EGF和胰岛素随泌乳时间变化的最优拟合曲线。乳蛋白、IGF- 、EGF和胰岛素含量随时间的延续而下降 ,其拟合方程分别为 :y=33.74 4+85 .80 3÷ x(g· L- 1 ) ,y=4 2 .5 94 +2 90 .0 2 3÷ x(μg· L- 1 ) ,y=132 .84 1+6 38.5 98÷ x(ng· L- 1 ) ,y=18.0 73+316 .92 3÷ x(U·m L- 1 ) ,其中 x为泌乳天数。乳糖的最优拟合曲线为对数曲线 ,乳糖含量随时间的延续而上升 ,其拟合方程为 :y=32 .2 2 3+9.6 2 6 lnx(g· L- 1 ) ,x为泌乳天数。猪乳成分变化最为剧烈的是在初乳期 。

猪乳中一组高分子量多态性蛋白质的同源性鉴定

利用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析等方法从猪乳中分离纯化高分子量蛋白质B (HMWP-B)。 制备兔抗HMWP-B的多克隆抗体,免疫印迹结果表明,不同带型的HMWP之间存在免疫交叉反应,说明该组蛋白具有同源性,为其多态性假说提供了证据。

用原位杂交法定位猪乳铁蛋白基因于染色体2q^(12)

本研究以非放射性标记的猪乳铁蛋白（ＰｏｒｃｉｎｅＬａｃｔｏｆｅｒｉｎ简称ＰＬＦ）ｃＤＮＡ为探针，通过染色体原位杂交法，对ＰＬＦ基因进行了染色体定位。实验中采用金胶抗体技术并结合使用银增强系统，提高了方法的灵敏度。利用染色体的组型分析，对杂交点的分布进行统计学分析。５２％（２６／５０）的分裂相在第２号染色体具银粒分布，实验结果表明：ＰＬＦ基因定位于猪２号染色体２ｑ１２区域。

猪乳中一组高分子量蛋白质的表达量与母猪泌乳性能关系的研究

通过设计的数学模型,分析了162头二花脸母猪和50头大约克母猪乳中一组高分子量蛋白质(HMWP)的基因表达量(HMWP浓度)与母猪泌乳性能的关系。结果表明,初乳和常乳中HMWP的基因表达量与乳中蛋白质和表皮生长因子(EGF)含量存在显著相关(P<0.05或P<0.01),其中常乳中HMWP的基因表达量与乳蛋白存在极显著正向线性相关(P<0.01)。常乳中HMWP基因表达量与乳糖含量也有正向线性相关的趋势(P<0.1),但与类胰岛素样生长因子-1(IGF-I)和胰岛素含量无显著相关性(P>0.1)。

猪乳中一组高分子量蛋白质的多态性及其与泌乳性能的关系

采用SDS PAGE法对 16 2头二花脸母猪和 5 0头大约克母猪乳中一组高分子量蛋白质 (HMWP)进行了检测 ,计算了该位点基因型频率、等位基因频率和遗传多样性指数 ,并运用线性模型统计方法分析二花脸母猪该位点不同基因型与母猪泌乳性能的关系。结果表明 ,在猪种群中 ,乳中HMWP存在A (相对分子质量 14 6 80 0± 14 0 0 ) ,B ( 114 80 0± 4 0 0 ) ,C ( 10 86 0 0 )和D ( 10 14 0 0± 6 0 0 ) 4种带型 ,分别受 4个等位基因HA、HB、HC 和HD 控制。在二花脸猪乳中HMWP表现出BB、BD和DD 3种基因型 ,其频率分别为 0 6 6 6 7,0 2 716和 0 0 6 17;两个等位基因HB 和HD 频率分别为 0 80 2 5和0 1975 ;遗传多样性指数为 0 3170。大约克猪乳中HMWP表现出BB、AB和BC 3种基因型 ,其频率分别为 0 880 0 ,0 10 0 0和 0 0 2 0 0 ;等位基因HA、HB 和HC 的频率分别为 0 0 5 0 0 ,0 94 0 0和 0 0 10 0 ;遗传多样性指数为 0 1138。在二花脸猪种群中 ,不同HMWP基因型在乳糖浓度上存在显著差异 (P <0 0 5 ) ,但在乳蛋白浓度差异不显著 (P >0 0 5 )。

猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)在毕赤酵母中的表达及抑菌活性鉴定

根据猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)的蛋白序列和毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过全基因合成法合成改造后的PLF-N基因片段,将其克隆到pGAPZα-A质粒中构建分泌型重组酵母表达载体pGAPZα-A-PLF。pGAPZα-A-PLF通过限制性内切酶AvrⅡ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168内。PCR检测结果发现,PLF-N基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在GAP启动子调控下,PLF-N重组蛋白获得分泌表达,其分子质量约为38ku,上清表达量约为364μg/mL。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,该表达产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)分别为12.5、25.0μg/mL。

猪乳中一组高分子量蛋白的多态性与乳生长因子、窝增重的关系(英文)

利用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板电泳 (SDS PAGE) ,对 162头二花脸母猪乳中一组高分子量蛋白质 (HMWP)进行了检测和分型 ,并运用线型模型统计分析方法分析了该基因座的不同基因型与母猪的乳生长因子 (IGF 1、EGF和胰岛素 )、哺乳仔猪生长 ( 2 0日龄窝增重 )的关系。结果表明 ,在三种HMWP基因型中 ,不同基因型母猪的乳中IGF 1浓度存在显著差异 ,HMWP基因型为BB型和BD型的母猪 ,其乳IGF 1浓度均高于DD型 ,其中BB型显著高于DD型 (P <0 .0 5)。乳中胰岛素浓度也存在差异的趋势 ,但未达到显著水平 (P >0 .0 5) ,BB型和BD型母猪的乳中胰岛素浓度高于DD型。HMWP基因座不同基因型的乳EGF浓度无显著差异 (P >0 .0 5)。在三种HMWP基因型中 ,不同基因型母猪的 2 0日龄窝增重存在显著差异 ,HMWP基因座为BB型和BD型的母猪 ,其 2 0日龄窝增重均高于DD型 ,其中BD型显著高于DD型 (P <0 .0 5)。实验结果提示 。

猪乳中一高分子量蛋白质的非血源性证据

目的探讨猪乳一高分子量蛋白质B(HMWP-B)是否来自于血液以及是否为猪乳所特有等问题。方法利用兔抗HMWP-B的多克隆抗体,通过免疫印迹实验来检测泌乳母猪血液中是否存在HMWP-B。结果实验结果证实HMWP-B在泌乳母猪血液中不存在,由此推测HMWP-B可能为来源于乳腺细胞自身合成而非血源性的乳蛋白;同时,结果还表明牛乳和兔乳中不存在HMWP-B,提示HMWP-B可能为猪乳所特有的乳蛋白。结论本实验为证明HMWP-B是由猪乳腺细胞自身合成而不是来自于血液的乳蛋白提供了一定的证据,这为深入开展该蛋白质的功能研究奠定了基础。

猪乳铁蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性研究

乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种天然活性铁离子结合糖蛋白,具有抗菌、抗病毒及调节免疫系统等功能。本研究将全基因合成的猪乳铁蛋白基因(Porcine Lactoferrin,PLF)在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行表达,表达产物主要以包涵体的形式存在;通过对温度、时间及诱导剂浓度等表达条件的摸索提高其表达量;表达的包涵体经裂解和纯化后,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)以琼脂扩散法进行体外抑菌活性检测,并以透射电镜观察法研究猪乳铁蛋白对该菌的抑制作用机制;检测重组猪乳铁蛋白体外对水疱性口炎病毒(VSV)在MDCK(Madin-Daby canine kidney)细胞上的增殖抑制作用。结果表明,PLF在大肠杆菌中成功表达约79ku;重组菌在32℃经0.8 mmol·L-1IPTG诱导3 h可获得最佳表达量,重组蛋白占菌体蛋白的31.4%;琼脂孔穴扩散抑菌圈法结果表明0.1 mg的重组猪乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌的最大抑菌直径达15 mm,透射电镜观察可见经重组猪乳铁蛋白作用后,细菌细胞壁和胞浆内电子密度都降低,菌体细胞壁及细胞膜出现断裂,核心溶解,菌体近似空壳;体外抗病毒试验结果表明,该蛋白可以明显的抑制VSV在MDCK细胞上细胞病变的产生。结果显示,重组的猪乳铁蛋白具有一定的抗菌和抗病毒活性,为其在生产中进一步应用奠定基础。

检测猪乳中抗轮状病毒IgA的ELISA方法研究

本文建立了一种用于检测猪乳中抗轮状病毒免疫球蛋白Ａ的ＥＬＩＳＡ方法。用于包被检测微滴板的轮状病毒抗原系从ＭＡ８６株轮状病毒细胞培养物中纯化，为辣根过氧化物酶与羊抗猪ＩｇＡ的偶联物。用重盐牛乳稀释剂能有效地抑制样品对测定板的非特异性吸附。被测样品采自疫苗免疫母猪和对照母猪。ＥＬＩＳＡＩｇＡ滴度定义为能得到光密度０．１的最大稀释倍数的倒数。试验结果表明，免疫母猪乳的ＩｇＡ含量比对照猪高得多。