猪传染性胃肠炎病毒S基因RAA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种基于猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S基因便捷、高效和特异的由重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aid amplification,RAA)检测方法。通过基因组序列比对,选择TGEV S基因中特定片段为检测靶标,构建重组质粒pUC57-S,设计并筛选RAA引物和探针;建立RAA检测方法;评价该方法灵敏度、特异性和重复性;运用该方法检测腹泻临床样品,与荧光定量PCR方法比较检测结果的符合率。结果确定最佳引物对F2/R1和探针PF2;该方法在40℃恒温条件下,30 min即可完成反应;荧光型RAA法最低检出限可达1.34×10^(1)copies·μL^(-1);与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪呼吸道冠状病毒等常见猪源病毒核酸无交叉反应;采用该方法检测107份临床样本,阳性率为5.61%(6/107),与荧光定量PCR法相比较,检测结果一致。本研究成功建立了一种灵敏、特异、可视化的RAA检测方法,可摆脱对昂贵设备、专业人员和检测技术的依赖,为临床检测TGEV提供良好的技术基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组乳酸菌免疫小鼠的研究

将含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸菌PNZ8149/NZ3900口服(灌胃)免疫BALB/C小鼠,第3次加强免疫后10 d捕杀小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后采用T淋巴细胞增殖试验及间接ELISA方法,检查免疫小鼠对外源基因表达产物的应答情况。结果表明,含有S基因的重组乳酸菌经口服免疫小鼠后,血清中的IgG、粪便中的sIgA与对照组有明显的差异(P<0.05)。结果说明,含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸菌,可以诱导小鼠产生良好的针对猪传染性胃肠炎病毒的全身体液和黏膜免疫应答。

猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建

用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达

采用基因重组的方法构建了含有猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K-ts,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达外源蛋白的毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-ts。表达蛋白经Dot-ELISA检测具有良好的抗原性。本研究为TGE的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。

以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建

应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间的目的片段经克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达其融合蛋白。结果显示,目的片段的大小为357bp,序列分析表明,S基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测表明,分子质量约34ku的融合蛋白具有良好的反应原性。

猪传染性胃肠炎病毒S基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测的标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增,并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明:该方法检测灵敏度可达30拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点,可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。

猪传染性胃肠炎病毒S基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体p ET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 k Da。Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。结果显示,3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为进一步鉴定不同编码区的免疫原性及抗原保护能力奠定了基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) S蛋白可诱导中和抗体 ,是主要保护性抗原 ,N端抗原位点 B和 C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失[1 ,2 ,5] 。体外扩增 TGEV S基因 B、C抗原位点 35 7bp片段 (TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将 TS克隆到原核表达载体 p GEX- 6 P- 1中 ,转化大肠杆菌中。经 IPTG诱导后 ,SDS- PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶 (GST,大小约为 2 6 ku)融合后大小约为 4 0 ku,目的蛋白分子量约为 13.2 ku,优化表达条件后表达量达 37.9%

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点片段的真核表达

为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,在倒置荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光分布于阳性细胞,并且RT-PCR检测结果显示,RT-PCR扩增产物与目的基因片段大小相符,证明其确实源于重组质粒转录后的mRNA。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建

参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因B、C抗原位点序列,应用Prim-er6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy-T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a(+)和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a(+)多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357 bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEV S基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠体液免疫功能变化的研究

本实验对TGEV S基因核酸疫苗免疫后体液免疫功能变化进行了研究,同时比较了两种核酸疫苗单独免疫小鼠后体液免疫应答的变化,证明重组核酸疫苗诱导小鼠产生体液免疫应答。

猪传染性胃肠炎病毒S基因转基因玉米植株的构建及鉴定

为构建猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因转玉米植株,本研究以玉米自交系"丹598"和"H99"的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验,确定了卡那霉素40mg/L～56mg/L为愈伤组织适宜选择压。利用农杆菌介导法将TGEV S基因导入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行了优化。结果表明,根癌农杆菌EHA105的菌液OD600nm值为0.5～0.6时,侵染20min为农杆菌转化的最适条件。并对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR和Southern blot检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

猪传染性胃肠炎（TGE）是由传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的高度接触传染性疾病,以仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为临床特征。该病毒主要编码纤突蛋白（S）、膜结合蛋白（M）、核蛋白（N）和小膜蛋白（s M）4种结构蛋白[1-2]。其中S蛋白是惟一能诱导机体产生中和抗体的结构蛋白[3]。

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)全长S基因插入pAdTrack-CMV穿梭质粒中,形成的转移质粒pAdTrack-CMV/S线性化后,用pAdEasyTM系统电转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠埃希氏菌BJ5183,经同源重组,构建了含有全S基因的重组腺病毒载体,经酶切充分暴露反向末端重复序列后,与脂质体混合转染AD-293细胞,成功获得了AD-S复制缺陷型腺病毒,经检测证实,AD-S稳定性好,安全性高。转录水平检测证实,S基因得到了转录;荧光检测发现,外源蛋白已得到表达。

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在巴斯德毕赤酵母KM71中的表达

猪传染性胃肠炎（TGE）是猪的一种急性、高度接触性传染病，各种年龄及品种的猪对本病均易感，其中2周龄以下仔猪的死亡率可达100％。该病病原为猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

研究目的对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。方法参考GenBank上公布的TGEVS基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoRI和XholI对表达载体PET-32a(+)和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a(+)多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因A抗原位点的原核表达载体。结论TGEVS基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠免疫器官病理组织学变化的研究

本实验对TGEVS基因核酸疫苗免疫后免疫器官的变化进行了研究,同时比较了两种核酸疫苗单独免疫小鼠后免疫器官的变化,证明重组核酸疫苗诱导小鼠产生免疫应答。