异种器官移植中猪内源性逆转录病毒的检测

猪来源的细胞、组织和器官可用于多种疾病治疗。但存在猪传染性病原体感染人体宿主的风险,包括含有3种亚型的猪内源性逆转录病毒(PERVs):PERV-A,PERV-B和PERV-C。异种器官移植的检测应包含筛选猪群的来源(PERV-A和PERV-B和PERV-C表达水平的检测)和受体的筛选(区分PERV之间的转递性和嵌合性)。这些测有助于降低PERV传播感染的可能性并对提高异种器官移植的安全性具有重大的意义。

猪内源性逆转录病毒在异种移植中的感染风险

猪作为异种移植供体可有效解决人类同种移植供体短缺的问题,但猪内源性逆转录病毒具有潜在的感染风险,严重影响了猪器官、组织、细胞在临床中的应用。因此,在异种移植应用于临床前,阐明猪内源性逆转录病毒的感染风险性至关重要。

猪内源性反转录病毒在异种移植中的研究进展

供体短缺是器官移植面临的最大问题，绝大多数终末期脏器功能衰竭患者因缺乏供体器官而死亡。器官共享联合网络（United Network for Organ Sharing，UNOS）数据显示，截止2018年3月在美国有114965个人排队等待器官移植，在这些人当中有74816人亟需进行移植。

猪内源性逆转录病毒体外感染人胚肾细胞系HEK-293的初步研究

目的 对猪内源性逆转录病毒(PERV)体外感染人胚肾细胞系HEK 293的能力进行检测。方法 建立体外感染人胚肾细胞系HEK -293的方法,用免疫电镜的方法观察PERV粒子,聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)检测与PERV共培养24h后HEK 293细胞基因组中PERV前病毒基因的整合、表达并对PERV亚型进行鉴定,激光共聚焦显微镜检测PERV -gag蛋白的表达并进行定量分析。结果 电镜下可观察到PERV的圆形病毒粒子;与PERV共培养24h后HEK -293细胞基因组中检测到PERV前病毒DNA,且mRNA也有效表达,PERV亚型为PERV -A,B型;激光共聚焦显微镜观察到PERV -gag蛋白在感染细胞HEK- 293的胞质表达,但表达量下降。结论PERV具有体外感染人胚肾细胞系HEK- 293的能力,病毒蛋白可以有效表达,因此在猪到人的异种器官移植研究中对PERV可能引起的人兽共患病进行安全性评价是极有必要的。

猪作为异种器官移植供体的研究进展

异种器官移植是现代和未来医学的重要研究领域之一 ,转基因猪有望为人类提供移植所需的器官。本文对猪作为异种器官移植供体的可能性、移植引起的免疫排斥反应及病毒感染等问题进行了综述和讨论。

湖南诞生异种移植用供体猪“安全猪异种一号”

据2012年8月22日《光明日报》消息，中南大学湘雅三医院医用级动物供体培育中心育成了异种移植用“安全猪异种一号”。标志我国异种移植研究跨人世界先进行列。研究表明，猪最适合于用作异种移植器官供体物种。猪的心脏、肝脏、肾脏、胰岛、神经细胞以及软骨细胞，与人的相应器官、组织和细胞在结构、功能上几乎完全一致，移植到患者身上后完全可以发挥原有器官的作用。此外，猪资源丰富、易于喂养、价格便宜，是可提供移植动物中最理想的物种。但是成年猪体携带120多种病毒，将导致不可预见和控制的风险。特别是一种名为PERV-C的猪内源性逆转录病毒，对异种移植成败影响极大。目前专家已经确定15种病毒绝对不能在供体猪中存在。

猪肝脏作为人体移植供体不安全

研究人员试图繁殖和饲养没有感染人体病毒的猪所做出的努力似乎必定要告失败。这一发现使人们对应用遗传工程“具有人性化的”猪肝脏作为移植器官的安全性更加担忧。而且,这件事发生在美国人员加速检验这些肝脏的一项试验时,这些肝脏是用于作为病人等待人体肝脏时的一个暂时性“桥梁”。大西洋两岸的公司,其中包括剑桥的Imutran和新泽西州Princeton的Nextran公司。

PERV病毒在异种移植中的感染风险及预防对策

猪与人体在器官结构、生理解剖上相似性高,被认为是最佳的异种移植供体,能够有效解决人类供体器官短缺的问题。猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)是一种C型逆转录病毒,以一种前病毒DNA的形式整合在猪的细胞基因组中,随细胞染色体的复制而复制,无法通过无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)培育消除,其在异种移植中具有潜在的感染风险。了解PERV的特性,探索PERV预防策略,将有助于猪作为异种移植供体在临床的应用。

多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道

目的探讨目前国际上基因改造程度最大的基因编辑猪在临床前异种器官移植中的应用前景。方法将1只猪内源性逆转录病毒(PERV)敲除联合3种主要异种抗原基因敲除以及抑制补体活化、调节凝血紊乱、抗炎抗吞噬的9种人源化基因转入猪(PERV-KO/3-KO/9-TG)作为供体,获取其心脏、肝脏和肾脏,分别移植给3只恒河猴受体,建立猪-猴异种器官移植临床前研究模型。观察血流重建后各移植物的功能状态并总结受体存活情况;监测移植物的血流动力学情况;比较各器官移植受体的血液学指标变化;观察移植物组织病理学表现。结果血流重建后各移植器官颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好。术后1 d,移植心脏、肝脏和肾脏均表现为动、静脉血流状态充盈,灌注情况良好。心脏、肝脏和肾脏移植受体的术后存活时间分别为7 d、26 d和1 d。心脏移植受体术后1 d肌酸激酶、肌酸激酶同工酶以及乳酸脱氢酶水平均升高,至术后6 d逐渐恢复至接近正常水平。术后7 d各项指标均急剧升高。肝脏移植受体术后2 d天冬氨酸转氨酶水平升高,术后10 d转氨酶基本恢复正常,但总胆红素持续升高。术后12 d天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平均出现升高,至术后15 d达到高峰。肾脏移植受体术后1 d出现轻微蛋白尿,后因突发严重心律失常死亡。组织病理学显示心脏和肾脏移植物组织结构接近正常,移植肝脏表现为片状坏死,肝组织结构出现紊乱,并伴有炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病形成。结论PERV-KO/3-KO/9-TG猪在克服超急性排斥反应、缓解体液性排斥反应及凝血紊乱方面具有一定优势,但其能否作为临床异种器官移植潜在供体需进一步评估。

五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展

为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展。

异种移植中预防传染性病原体传播的研究进展

异种移植中采用猪的细胞、组织和器官可能导致猪传染性病原体的转移,进而感染人受体,甚至引发人畜共患的疾病。为防止此情况发生,应对供体动物进行广泛的微生物筛选,包括细菌、病毒、真菌和其他微生物。在进行移植之前,供体猪可进行长时间的筛选,故异种移植将比同种异体移植变得更为安全。通过实施剖腹产、接种疫苗等策略可以筛选出不转移不传播微生物的供体动物。猪内源性逆转录病毒(PERV),整合于所有猪的基因组中,上述方法不能清除PERV,因此需选择病毒低表达的猪或构建PERV表达抑制的基因修饰猪。

CRISPR-Cas9灭活逆转录病毒

常用和熟知的猪器官移植给人类的是心脏瓣膜，但是想要将整个猪器官移植到人体并不是这么简单的事。除了受者免疫系统倾向于排斥异体组织所面临的常规挑战外，利用猪器官填补人器官供应和需求之间的巨大缺口还必需解决猪内源性逆转录病毒（ porcine endogenous retrovirus, PERV）带来的问题。

异种器官移植的进展及展望

在全球范围内,因终末期器官衰竭而需要器官移植的患者人数不断增加,但从已故或活体捐赠者获得的器官数量非常有限。因此,利用猪器官/组织进行异种移植是解决器官供给短缺的最终办法之一。尽管异种器官移植的研究取得了很大进展,然而,要真正走向临床仍然存在许多障碍,特别是免疫排斥问题。随着该领域研究的不断深入,特别是各种基因编辑技术的发展,实现对猪产生超急性排斥的基因敲除及猪的多种基因进行人源化改造,再在非人类灵长类动物移植模型中进行安全性及功能性评估,移植器官的存活率显著提高。利用CRISPR/Cas9技术将猪内源性逆转录病毒(PERV)从猪基因组中去除,避免了异种器官移植后内源性病原体感染宿主的潜在风险,具有里程碑意义。本文对异种移植研究需要跨越的障碍、进展、安全、监管和现状等进行了综述。

利用CRISPR/Cas9技术构建PERV敲除的PK15细胞系

[目的]利用CRISPR/Cas9技术对猪内源性逆转录病毒(PERV)进行编码区的大片段敲除,获得PERV敲除的阳性PK15单克隆细胞系。[方法]通过对巴马小型猪基因组进行高通量测序,获得PERV高度保守序列,再根据CRISPR/Cas9的构建原理,设计2个gRNA,并将其同时整合入含有PB转座子的可表达Cas9蛋白的载体中,即PB-CAG-2×gRNA-Cas9载体。然后以电转方式将打靶载体转入PK15细胞中,并通过药物(G418)筛选方法筛出单细胞克隆。通过PCR鉴定,挑出阳性克隆,并将其传代扩大获得细胞系。[结果]酶切、测序验证了载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9的正确性,PCR结果显示7株单克隆细胞系均有约3600bp的PERV大片段敲除。[结论]构建了PERV敲除的基因打靶载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9,并利用该载体成功打靶获得了7株PERV大片段敲除的PK15细胞系。