川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

本工作旨在研究川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞钾通道的作用,为阐明其扩张冠状动脉血管的机制提供实验依据。采用膜片钳细胞贴附式和内面向外式记录方式观察川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+- activated potassium channels,BKCa channels)的作用,分别用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89和蛋白激酶G (protein kinase G,PKG)抑制剂KT-5823处理细胞,再观察川芎嗪对BKCa通道作用的变化。结果表明在研究的0．73-8．07 mmol/L浓度范围,川芎嗪可以剂量依赖性地激活BKCa通道,使通道的开放概率从(0．01±0．003)增加到(0．03±0．01)-(．21± 0．18)(P<0．01,n=10),使通道平均关闭时间从(732．33±90．67)ms降低到(359．67±41．30)-(2．96±0．52)ms(P<0．01, n=10)。川芎嗪的这种激活作用在浴液游离钙离子浓度接近0 mmol/L时也存在。PKA的特异性抑制剂H-89(3 μmol/L)和 PKG的特异性抑制剂KT-5823(1 μmol/L)对川芎嗪激活BKCa通道的作用无影响。以上结果提示:川芎嗪能直接激活冠状动脉平滑肌BKCa通道,这种作用可能是川芎嗪扩张冠状动脉血管的一种重要机制。

在inside-out膜片上caffeine对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的调节作用及ryanodine的影响

目的:利用膜片钳技术,研究咖啡因对钙激活钾通道(calcium-activated potassium channel,KCa)的作用机制,及咖啡因存在时兰尼定(ryanodine)对KCa的影响以阐明冠状动脉平滑肌的调控机制。方法:采用急性酶分离方法,应用膜片钳单通道电流记录技术记录猪冠状动脉平滑肌钿胞上KCa电流活动。电流信号经放大、滤波及A/D、D/A转换后输入微机进行采样和储存。应用PCLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在内面向外式(inside-out)膜片下,咖啡因(0.1、0.5、1.0、5.0mmol/L)可浓度依赖性地增加通道开放概率,而对电流幅值无明显影响,开放概率增加是通过明显缩短平均关闭时间实现的(n=8,P<0.01);洗去药物后通道活性可以恢复到对照水平;5.0mmol/L咖啡因对KCa激活作用最大(P<0.01)。在细胞贴附式(cell-attached)膜片上,咖啡因激活KCa后,ryanodine(10-40μmol/L)浓度依赖性地抑制通道开放概率,开放时间缩短,关闭时间延长,对电流幅度无明显影响。结论:在inside-out膜片下,咖啡因能够直接激活猪冠状动脉平滑肌细胞KCa通道。在cell-atta-ched构型上,ryanodine可通过胞内一定的信号通路浓度依赖性间接抑制咖啡因对KCa激活。

RyR与PKC在UTP对猪冠状动脉平滑肌上STOCs调控中的作用

目的探讨三磷酸尿苷(UTP)对STOCs作用的胞内信号转导机制及RyR、PKC对其过程的干预作用。方法应用全细胞穿孔膜片钳记录技术,观察三磷酸尿苷(UTP)对猪冠状动脉平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道(BKCa)介导的自发性瞬时外向钾电流(STOCs)的作用,及兰诺定受体(RyR)和蛋白激酶C(PKC)的特异性阻断剂ryanodine、BisI预处理细胞后UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞STOCs的作用。结果①50μmol/L的UTP可使STOCs的幅度与频率明显增加(23.53±2.55)pA,(0.2167±0.0217)Hzvs(40.76±5.75)pA,(0.3695±0.0358)Hz,n=7,P<0.01。②50μmol/L ryanodine处理细胞后,50μmol/L UTP不能再激活STOCs。③5μmol/L的U-73122处理细胞后,50μmol/L UTP也不能激活STOCs(22.76±6.43)pA,(0.2227±0.0977)Hzvs(23.28±8.43)pA,(0.1953±0.061)Hz;n=7,P>0.05。④1μmol/L的BisI处理细胞后,50μmol/L UTP仍可激活STOCs(46.32±6.17)pA,(0.407±0.061)Hzvs(65.53±8.34)pA,(0.6937±0.0597)Hz;n=10,P1<0.05,P2<0.01,且BisI存在时UTP对STOCs的激活作用明显大于UTP单独存在时的激活作用(n=10/7,P1<0.05,P2<0.01)。结论 PLC、RyR和PKC均参与了UTP激活猪冠状动脉平滑肌上STOCs的过程。

UTP经PLC-IP_3信号通路调控猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流

本文采用全细胞穿孔膜片钳技术研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cells,CASMCs)自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents, STOCs)的作用,探讨细胞内Ca2+释放在UTP产物三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate, IP3)调控STOCs过程中的作用机制。结果显示:(1)UTP(40 μmol/L)可明显激活CASMCs的STOCs,使其幅度和频率分别增加(57.54±5.34)% 和(77.46±8.42)% (P<0.01, n=38)。(2)磷脂酶C(phospholipase C, PLC)阻断剂U73122(5 μmol/L)可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.04±7.46)%和(41.65±16.59)%(P<0.05, n=10);细胞外再加入UTP 不能再次激活STOCs (n=7)。(3)L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca2+ channels, L-VDCCs)阻断剂verapamil (20 μmol/L)和CdCl2(200 μmol/L)几乎不影响UTP对STOCs活性的调节(n=8)。 (4)1 μmol/L 的bisindolylmaleimide I [BisI,蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的特异性阻断剂]可明显激活 STOCs,使其幅度和频率分别增加(65.44±24.66)%和(61.35±21.47)%(P<0.01,n=12),细胞外再加入UTP (40 μmol/L)可使STOCs的幅度及频率进一步明显增加(P<0.05,P<0.01,n=12),细胞外继续加入ryanodine (50 μmol/L)则可完全阻断STOCs。(5)UTP(40μmol/L)预处理细胞后,IP3受体(IP3 receptors, IP3Rs)阻断剂2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB,40μmol/L)可使STOCs的幅度降低(24.08±3.97)%(P<0.05, n=8),对其频率的影响较小(n=8) ;而80 μmol/L的2-APB则可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.43±6.34)%和(40.59±19.01)%(P<0.05, P<0.01, n=6),细胞外继续加入高浓度的ryanodine(50 μmol/L)可完全抑制STOCs(n=6)。用2-APB (40 μmol/L)或ryanodine(50 μmol/L)预处理细胞后,UTP(40 μmol/L)不能再次激活 STOCs。以上结果提示:UTP主要通过PLC-IP3信号通路激活急性酶分离的猪CASMCs的STOCs,IP3Rs和ryanodine受体(ryanodine receptors,RyRs)介导的细胞内Ca2+释放在此过程中发挥重要作用。

Cell-attached膜片上,咖啡因对猪冠状动脉平滑肌细胞K_(Ca)的调节作用

目的:研究咖啡因对猪冠状动脉平滑肌细胞KCa通道的调控机理,以期揭示胞内钙库RyR激活后,局部钙离子浓度升高和KCa的关系。方法:采用急性酶分离方法,应用膜片钳单通道电流记录技术记录大脑皮层神经元猪冠状动脉平滑肌细胞上KCa通道电流活动。电流信号经放大、滤波及A/D、D/A转换后输入微机进行采样和储存。实验数据应用CLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在cell-attached膜片上咖啡因对KCa通道有明显的作用,咖啡(0.1-5.0 mM)可以增加通道的开放概率(NPo),呈现出浓度依赖性,开放时间延长,关闭时间也随之缩短,而对电流幅值无明显影响,开放概率的增加是通过明显缩短平均关闭时间实现的(n=8,P<0.05);洗去药物后通道活性可以一定程度的恢复到对照水平,再加入一定浓度咖啡因(如1.0mM)可再次激活KCa,激活程度与洗脱前较接近。结论:在细胞贴附式构型上咖啡因浓度依赖性地激活KCa,有饱和性。可能是通过影响胞内信号转导过程而调控KCa活性。

大鼠血清对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用

目的研究大鼠血清对猪冠状动脉平滑肌细胞(SMC)钙激活钾通道(KCa)的作用,为血清药理学方法与膜片钳技术结合应用于相关离子通道机制研究奠定基础。方法用EGTA处理血清中的Ca2+、Mg2+等离子,用膜片钳单通道技术研究处理后的血清对SMC上的KCa的影响。结果处理后的血清浓度依赖性的不可逆性的阻断SMC上的KCa。在细胞贴附式膜片(cell-attached patch)下,血清10、50、100、150μl·ml-1,使通道开放概率从0.0285±0.0102分别降低到0.0205±0.0046(n=7,P>0.05)、0.0145±0.0007(n=7,P<0.05)、0.0045±0.0002(n=7,P<0.01)、0(n=7,P<0.01)。在内面向外式膜片(inside-out patch)下,血清10、50、100、150μl·ml-1,使通道开放概率从0.3821±0.0491分别降低到0.1298±0.0331(n=7,P<0.05)、0.0405±0.0048(n=7,P<0.05)、0.0117±0.0011(n=7,P<0.01)、0.0008±0.0005(n=7,P<0.01)。随着血清浓度的增加,通道活动逐步减少至完全抑制,这种作用冲洗后不可逆。结论血清对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道有一定阻断作用。

粉防己碱对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用

目的:研究粉防己碱(Tet)对猪冠状动脉平滑肌细胞(SMC)钙激活钾通道(K_(Ca))的作用。方法:用膜片钳单通道技术确定通道的变化。结果:Tet 浓度依赖性地可逆性阻断 SMC 上的 K_(Ca)。细胞膜内侧面加入 Tet 20、30×10^(-6)mol·L^(-1)可分别使通道开放概率降低(58.2±20.3)%、(64.6±16.6)%,平均开放时间从(2.3±0.7)ms 减少到(2.0±0.8)ms 和(1.6±0.6)ms,平均关闭时间从(68.1±39.3)ms 减少到(64.0±62.4)ms 和(37.0±16.6)ms。随 Tet 浓度的增加,通道活动逐步完全抑制。结论:Tet 是一种天然有效的SMC 上 K_(Ca)抑制剂。

PKC在UTP调节猪冠状动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道中的作用

目的:研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa通道的作用,探讨PKC在其过程中的作用机制。方法:应用cell-attached技术记录急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa电流。用pCLAMP10.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在cell-attached膜片上,80μMUTP可明显激活BKCa通道(P<0.05,n=21)。PLC抑制剂U73122可抑制UTP对BKCa的激活作用(P<0.05,n=5)。PKC激动剂PMA(10nM),可使BKCa通道开放概率明显降低(P<0.05,n=9)。UTP(80μM)预处理细胞之后,PKC特异性抑制剂Bis-Ⅰ(1μM),可使BKCa通道开放概率进一步增加(P<0.05,n=9)。结论:在cell-attached膜片上,UTP经由PLC信使转导通路激活猪冠脉平滑肌细胞BKCa通道;PKC对此过程具有干预作用。

UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道作用机制的研究

目的:利用膜片钳技术,研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa通道的作用,探讨生理条件下UTP调节BKCa通道的机制。方法:应用Cell-attached技术记录急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa电流。用pCLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在Cell-attached膜片上,80μM UTP可明显激活BKCa通道(P<0.05,n=21)。PLC抑制剂U73122可抑制UTP对BKCa的激活作用(P<0.05,n=5)。PKC激动剂PMA(10nM),可使BKCa通道开放概率明显降低(P<0.05,n=9)。UTP(80μM)预处理细胞之后,IP3抑制剂2APB(80μM),可使BKCa通道开放受抑(P<0.05,n=6)。结论:在Cell-attached膜片上,UTP能激活猪冠脉平滑肌细胞BKCa通道。PLC信使转导通路中的IP3介导的胞内Ca2+释放是UTP激活BKCa通道的重要途径。