猪卵透明带-3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究

目的:制备具有猪卵透明带-3β抗原活性的截短型pZP3β蛋白(tunc-pZP3β),以便对该蛋白的抗原表位区域作深入研究。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第130个氨基酸到第290个氨基酸的DNA序列。获得的tunc-pZP3β基因片段通过引入其两端的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点被定向插入pET-3c质粒T7强启动子下游的多克隆区,筛选出重组子,经DNA测序验证正确后,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,再用IPTG对重组菌体进行诱导。结果:SDS-PAGE分析表明tunc-pZP3β在大肠杆菌系统中高水平表达,且在WesternBlot免疫印迹中能被特异性抗体识别。结论:对适当的抗原表位序列进行保留而截去两端一定的氨基酸序列,所获得的截短型蛋白能够实现在大肠杆菌中高效表达,这有利于深入研究该蛋白核心区域的功能。

猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达

目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。

重组猪卵透明带-3α抗原及其抗体的制备

目的:制备重组猪卵透明带-3α(rpZP3α)抗原及其抗体供发展避孕疫苗研究。方法:在2L发酵罐中接种毕赤酵母GS115-pZP3α工程菌,高密度发酵表达rpZP3α蛋白,表达的蛋白经螯合镍离子的亲和柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析。rpZP3α免疫家兔,间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。IVF试验体外检测抗rpZP3α抗体对猪、小鼠精卵结合的影响作用。结果:工程菌高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,平均产量为8mg/L,用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,间接免疫荧光法分析显示此抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。体外精卵结合试验中,随着兔抗rpZP3α抗血清浓度的加大,其对猪、鼠精卵结合的抑制作用也增强。ELISA结果显示抗rpZP3α抗体与rpZP3α蛋白以及天然pZP3蛋白两种抗原反应的强度和趋势基本一致。结论:通过酵母体系制备的rpZP3α及其抗体具有免疫学活性。

基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化

目的:对已构建好的表达pZP3β蛋白(pZP130)工程菌的培养条件进行优化,通过在5L罐中发酵和Ni柱纯化,以期获取较大量目的产物。方法:在摇瓶中改变不同的培养及诱导条件,比较工程菌的生长和目的蛋白的表达,优化发酵条件;并在5L发酵罐中进行发酵,获得菌体,破碎后进行Ni柱纯化。结果:优化的发酵条件是:10%的接种量,加入2%甘油的培养基培养菌体3h后加入0.5mmol/LIPTG,诱导4h后收样。在5L发酵罐中发酵,获得菌体量36g/L,经Ni柱纯化,获得蛋白粗制品33mg/L发酵液。结论:截短型pZP3β蛋白可以在E.coli中获得较高表达,并且可以通过发酵和Ni柱纯化得到较大量的蛋白,这有助于pZP的深入研究和应用。