重组猪α干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达

用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素 (PoIFN α)第 86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC) ,同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC ,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX IFN ,表达产物占菌体总蛋白的 2 0 %。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理 ,并以FPLC进一步纯化 ,得到了具有较高生物活性的产物 (5 2 0 0IU mg)。

猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有猪γ-干扰素(porcine interferon-γ,PoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-PoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达PoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗进行Western blot、间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,结果表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得正确表达。抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达rPoIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在猪肾细胞系(PK-15)的复制,rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清抗病毒活性为2×104抑制单位(IU)/mL,其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清有效阻断。结果表明rPoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ在感染昆虫细胞获得有效表达,并具有高效抗病毒活性。

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。

重组猪γ干扰素对仔猪外周血T淋巴细胞亚群及IL-2、IFN-γ水平影响的研究

选28日龄健康仔猪16头,随机分为4组。1组为对照组,肌肉注射生理盐水;2-4组为试验组,分别肌注重组猪IFN-γ注射液（rpoIFN-γ）4万、40万、400万单位/头,注射液体积均为4 ml,研究rpoIFN-γ对猪外周血T细胞亚群及血清IL-2、IFN-γ含量的影响。结果发现：2组在试验第7天CD3^＋亚群比例、第7天和第14天CD4^＋亚群比例及CD4^＋/CD8^＋比值、第1天和第3天血清IL-2水平显著高于对照组（P〈0.05）;3组在试验第14天CD3^＋和CD4^＋亚群比例、CD4^＋/CD8^＋比值、血清IFN-γ含量,第7天、28天CD8^＋亚群比例,第14天、21天、28天血清IL-2含量显著高于对照组（P〈0.05）;4组CD8^＋亚群比例在第28天显著高于对照组（P〈0.05）。表明注射rpoIFN-γ对仔猪的细胞免疫有促进作用,肌注的适宜剂量是40万单位/头。

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107TCID50/mL。RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。

重组猪α干扰素抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞增殖的初步研究

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)/Marc-145细胞体系验证重组猪α干扰素(rPoIFN-α)制剂的抑制病毒作用。结果表明:rPoIFN-α稀释至10^(10)可有效预防PRRSV感染Marc-145细胞;当rPoIFN-α稀释至10~8可有效抑制病毒在Marc-145细胞上的增殖。研究结果在细胞水平上明确了rPoIFN-α对PRRSV的抑制作用,为进一步将rPoIFN-α应用于动物试验提供了参考。

重组猪干扰素α1冻干粉针剂对猪的安全性试验研究

试验旨在观察自行研制的重组猪干扰素α1冻干粉针剂对猪的安全性。将20头健康仔猪随机分为4组(3组试验组和1组对照组),每组5只,3组试验组分别肌肉注射低、中和高剂量重组猪干扰素α1冻干粉针剂,连续注射7d,对照组同时肌肉注射生理盐水。对动物基本生命体征、血常规、血液生化指标、组织标本病理学指标进行观察。各试验组仔猪的外表及行为特征均正常;体温、体重的变化也在正常范围之内;重要脏器如脑、肺脏、肝脏、心脏和脾脏病理解剖HE染色结果显示无器质性病变发生;血常规、血液生化指标均正常。试验结果表明本项目研制的重组猪干扰素α1冻干粉针剂对仔猪无明显毒副作用,使用安全。

重组猪干扰素-γ的体外抗弓形虫作用

在体外以不同剂量的重组猪IFN-γ刺激PK15细胞和猪腹腔巨噬细胞,观察了其对弓形虫入侵细胞和在细胞内增殖的影响。结果表明,随着重组猪IFN-γ剂量的增大,巨噬细胞的抗弓形虫作用逐渐增强,而不同浓度的重组猪IFN-γ对弓形虫入侵PK15细胞均无明显影响。推测重组猪IFN-γ可激活巨噬细胞抑制弓形虫的入侵和增殖,并与剂量有关;同时说明IFN-γ在非吞噬细胞内与在巨噬细胞内的作用不同。

重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选

为使重组猪α干扰素(rPoIFN-α)制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2%、4%和5%的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102.8%、95.1%、108.3%。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN-α的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。

重组猪α-干扰素的纯化及其抗病毒活性测定

分别采用PEG6000沉淀法和Sephadex G-50凝胶色谱法纯化毕赤酵母分泌表达的重组猪α-干扰素（PolFN-α）。正交试验结果显示：PEG6000沉淀法最佳分离条件为pH6．0、NaCl0．2mol／L、PEG60000．1g／mL，蛋白回收率约80％；纯化后蛋白效价为2．9×105IU／mL，比活为1．04x105IU／mg。通过SephadexG．50凝胶色谱纯化，重组PolFN-α的回收率为60％左右，纯度达到90％；纯化后蛋白效价为8×103IU／mL，比活为6．7×103IU／mg。

重组猪γ-干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

采用RT-PCR从猪外周血液淋巴细胞中克隆出猪γ-干扰素基因cDNA,构建了重组酵母表达载体(pPICZα-PoIFN-γ),并在巴斯德毕赤酵母X33株中实现了高效分泌表达,经SDS-PAGE和Western-blot证实猪γ-干扰素分子量为18 kD,细胞培养试验结果表明,重组猪γ-干扰素能抑制水泡性口炎病毒(VSV)对猪肾传代细胞(PK-15)的攻击;而在动物试验中,重组猪γ-干扰素可明显提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果。

重组猪α干扰素急性毒性研究

[目的]研究小白鼠体内重组猪α干扰素急性毒性反应,为临床安全用药提供依据。[方法]依据急性毒性实验原则,将小白鼠分为2大组:腹腔注射组和肌肉注射组,每组又分高、中、低3个剂量组,同时设正常对照组。给药后14d内连续观察小鼠行为活动等指标和毒性反应程度,取血作血液学检查和生化检查,以获得重组猪α干扰素初步毒性资料,并在实验结束时处死小白鼠进行剖检。[结果]各组小鼠外部表现及行为特征均正常,体温和体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液、生化指标与正常对照组无明显差异。[结论]该实验设定的猪α干扰素最高剂量(5.0×105IU/只)及其以下剂量,均对小白鼠无明显毒性作用,在临床上应用重组猪α干扰素是安全的。

重组猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化

干扰素（IFN）自1957年首次被发现,因其具有高效广谱的抗病毒活性而备受关注。目前,IFN也是动物体中所知作用最快的第一防御体系,多个物种的IFN已得到深入的研究,但对猪IFN的研究相对较少。猪IFN-α在抑制口蹄疫病毒活力方面具有明显的作用,

重组猪α干扰素防治仔猪流行性腹泻病试验及临床应用

针对近年在我国再次出现的猪流行性腹泻,尤其是造成初生仔猪大批死亡的情况,本试验应用酵母表达的重组猪α-干扰素开展初生仔猪流行性腹泻病的临床防治试验。选择了3个发病猪场,以口服重组猪α-干扰素方式进行防治。结果表明,口服重组猪α-干扰素对初生仔猪流行性腹泻具有较好的防治作用,仔猪存活率可达50%~70%。同时进行腹腔或/和口服补液,仔猪存活率从53%提升到71%。同时对重组猪α-干扰素进行临床防治应用,取得了较好的效果。

两种细胞株滴定重组猪α干扰素效价的比较研究

采用水泡性口炎病毒(VSV)作为攻击病毒,以微量细胞病变抑制法对同批次不同浓度的8组重组猪α干扰素(rPoIFN-α)样品进行了效价检测,以中国药品生物制品检定所指定使用的标化重组人α干扰素为效价滴定的参比标准,对在牛肾细胞(MDBK)株和人喉癌上皮细胞(HEp-2)株所得结果进行比较,并对细胞与待测样品按"一步法"和先加细胞,待细胞长满单层再加待测样品的"两步法"所得的rPoIFN-α抗病毒效价进行比较。结果表明:MDBK细胞株与HEp-2细胞株对于rPoIFN-α抗病毒活性检测结果无显著性差异,均可用于rPoIFN-α抗病毒活性的检测,重组人α干扰素滴定系统可用于rPoIFN-α效价检测。两种加样方法所得结果基本相同,推荐使用"一步法"。

重组猪干扰素α1冻干粉针剂在猪体内的药代动力学研究

为研究重组猪干扰素α1(rPoIFN-α1)冻干粉针剂在猪体内的药代动力学特征,本研究将实验猪随机分为3组:分别静脉、肌肉和皮下注射rPoIFN-α1 1.0×107IU,每组设立对照组,于注射后间隔不同时间采血,采用细胞病变抑制法测定其血清样品中rPoIFN-α1的效价。结果表明,肌肉注射组和皮下注射组药动学特征符合一室开放模型,呈一级动力学消除,血药峰时间(Tmax)分别为2.872±0.314 h和4.000±0.539 h,消除半衰期(T1/2)分别为6.236±0.551 h和6.644±0.751 h,血药峰浓度(Cmax)分别为3.980±2.875×104IU/L和1.080±0.986×104IU/L。静脉注射组符合二室开放模型,呈一级动力学消除,分布半衰期(T1/2α)为0.136±0.021 h,消除半衰期(T1/2β)为5.195±0.351 h,Cmax值为6.380±0.546×104IU/L。rPoIFN-α1静脉、肌肉和皮下注射组清除率分别为0.930±0.132 L/h、0.677±0.228 L/h和0.879±0.210 L/h。与静脉注射组相比,肌肉注射组的生物利用度为47.82%,皮下注射组的生物利用度为35.09%。本实验结果提示这3种rPoIFN-α1的注射方法在猪体内吸收、消除较快,具有线性动力学特征。rPoIFN-α1肌肉注射给药的生物利用度高于皮下注射组,消除半衰期比静脉注射组延长,可以作为替代静脉注射的一种方便和安全给药途径。

猪α干扰素重组腺病毒的构建与鉴定

猪的病毒性疾病种类多且危害大,因此研发具有广谱抗病毒作用的猪α干扰素制剂具有重大意义。为了研制重组猪干扰素类制剂防制猪病毒性传染病,构建了携带猪IFN-α基因的重组腺病毒。应用PCR方法从猪肝组织基因组中扩增得到猪IFN-α基因后,直接克隆入腺病毒载体穿梭质粒中,构建出腺病毒重组穿梭质粒pAd-CMV-IFN-α,经PmeⅠ线性化后转化BJ5183感受态细胞,获得同源重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后回收,脂质体介导下转染AD-293细胞,PCR检测表明成功构建了携带猪IFN-α基因的复制缺陷性重组腺病毒。

猪β干扰素基因17位丝氨酸突变体重组酵母表达载体的构建

根据猪β干扰素基因序列设计一对引物,并按酵母密码子的偏好性,在引物中对稀有密码子进行同义突变,即第3位的TAT基因突变为TAC,第7位的CGA基因突变为AGA,第164位的CGG基因突变为CGT。同时,利用聚合酶链式反应基因定点突变技术,把17位的半胱氨酸密码子TGT突变为丝氨酸密码子TCT,构建poIFNβSer17突变体,然后将突变体克隆到pP ICZαC质粒中。结果表明,通过上述方法获得的poIFNβSer17突变体,并成功构建poIFNβSer17-pP ICZαC重组酵母表达质粒。

鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子-猪干扰素α1融合基因在大肠埃希菌中的可溶性表达及其生物学活性研究

为可溶性表达重组鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(ChGM-CSF)与猪干扰素α1(PoIFNα1)融合蛋白,并研究其生物学活性,本研究分别提取鸡、猪肝脏细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增ChGM-CSF和PoIFNα1基因,经linker连接上述两种基因后将其克隆于pET-32a原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE和western blot检测融合蛋白表达产物。在ST细胞/VSV病毒测定系统以细胞病变抑制法滴定该融合蛋白的抗病毒活性;同时用MTT法检测其对鸡淋巴细胞增殖活性的促进作用。结果显示,PCR扩增并融合后的ChGM-CSF和PoIFNα1融合基因约为1000bp,构建重组表达载体后,诱导表达的rChGM-CSF-PoIFNα1融合蛋白分子量约55ku,主要存在于破碎菌体的上清中,表达量较高。Westernblot检测结果显示,该融合蛋白分别能够与ChGM-CSF多抗和PoIFNα单克隆抗体特异性结合,其抗病毒比活性约为1.1×10^6IU/mg,并且具有促进鸡淋巴细胞增殖的活性。本研究为rChGM-CSF-PoIFNα1重组融合蛋白的研制及其相关活性的测定提供实验依据。

重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的研究

为了观察重组猪α干扰素对高致病性猪蓝耳病临床治疗效果,采用毕赤酵母表达系统高效表达的重组猪α干扰素制剂,按照农业部颁布的《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》进行高致病性猪蓝耳病小量临床试验。结果表明,该制剂对高致病性猪蓝耳病的治愈率超过81%。