猪繁殖与呼吸综合征病毒促进猪链球菌2型感染猪肺泡巨噬细胞的初步研究

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对不同毒力猪链球菌2型(SS2)感染巨噬细胞的影响,本研究建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)的模型,实验分为4组:HA单独感染组(HA组)、PRRSV-HA共感染组(PRRSV-HA组)、T1/5单独感染组(T1/5组)和PRRSV-T1/5共感染组(PRRSV-T1/5组),利用该模型通过黏附试验、侵入试验和细胞内存活试验检测PRRSV对HA和T1/5黏附、侵入iPAM细胞及对该细胞存活率的影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测各感染组iPAM模型细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平。黏附试验结果显示,HA感染2 h后,PRRSV-HA组细菌对细胞的黏附水平极显著高于HA组(P<0.01或P<0.001);T1/5感染6 h后,PRRSV-T1/5组细菌对细胞的黏附水平极显著高于T1/5组(P<0.001),表明PRRSV与HA或T1/5共感染可以促进HA和T1/5对iPAM模型细胞的黏附,且HA对iPAM细胞的黏附水平高于T1/5。侵入试验结果显示,感染4 h后,共感染组细菌侵入iPAM细胞中的数量比单独感染组极显著增多(P<0.01或P<0.001)。细胞内存活试验结果显示,感染2 h后,共感染组细菌的存活率比单独感染组极显著升高(P<0.001)。荧光定量PCR试验结果显示,感染4 h时,共感染组iPAM细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平极显著高于单独感染组(P<0.001)。本研究首次建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染i PAM的模型,基于该模型研究首次发现PRRSV感染不仅促进了不同毒力SS2对i PAM细胞的黏附、侵入及SS2在iPAM细胞内的存活,还可以协同SS2显著提高该细胞中细胞因子的转录水平。本研究为进一步探究PRRSV和SS混合感染的机制提供了参考依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组毒株GX-C4CG6致病性探究

为评估猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组毒株GX-C4CG6对小猪的致病性,选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的小猪进行攻毒试验,然后通过攻毒后猪只体温变化及死亡情况、临床症状评分、血清抗体变化、攻毒后平均日增重、解剖后肺脏眼观及显微病理变化、血清/肺脏病毒拷贝数等指标,对该毒株致病性进行评估。结果显示:GX-C4CG6毒株攻毒组有4头猪出现发烧,平均体温在攻毒后第12、13天大于40℃,最高体温达40.4℃,未出现死亡;被攻毒猪仅表现轻微减料,未表现出明显的呼吸障碍;攻毒后7 d,攻毒组猪只抗体开始转阳,至攻毒后14 d,攻毒组猪只ELISA抗体S/P平均值达最高;攻毒组在攻毒后第1周和对照组平均日增重差异不显著,至第2周差异显著(P<0.05),攻毒组显著低于对照组;被攻毒猪出现肺脏间质性肺炎,血清和肺脏病毒拷贝数浓度较高,分别达9.2×10^(5)和1.6×10^(7)copies/mL。结果表明,PRRSV GX-C4CG6毒株对小猪表现温和致病性。本研究为PRRSV重组毒株流行的控制提供了基础资料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like株的分离鉴定及基因组分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)呈现全球流行,对养猪行业造成巨大的经济损失。为增加PRRSV分离细胞种类的多样性,同时了解新疆地区猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)遗传变异的现状,采用新鲜制备猪骨髓细胞诱导分化成猪骨髓源巨噬细胞,对新疆地区某猪场疑似患有PRRS的肺脏,接种至猪骨髓源巨噬细胞,分离获得1株PRRSV毒株,命名为XJYQ-2021。通过测序得到全基因组序列,对该毒株NSP2氨基酸序列缺失、ORF5及全基因组序列进行同源性、遗传进化及重组分析;利用间接免疫荧光试验进行鉴定,同时对第10、15、20代病毒液绘制生长曲线。结果显示,诱导分化的猪骨髓源巨噬细胞纯度高达90%以上,XJYQ-2021分离株在该细胞生长良好,可见明显细胞病变;通过生长曲线可观察到病毒含量随代次增加而递增,感染48 h左右病毒滴度达到峰值;该分离株基因组全长15030 nt,与美洲型NADC30同源性为90%;XJYQ-2021分离株与VR2332相比,NSP2氨基酸序列与美洲型NADC30具有相同不连续缺失(111+1+19);全基因重组分析结果表明,XJYQ-2021分离株是重组病毒,有一个重组片段,其中NADC30是亲本毒株,与JXA1之间发生重组获得。研究结果可为PRRSV的病毒分离提供优选细胞种类,同时掌握了新疆地区PRRSV流行毒株的遗传进化现状。

猪繁殖和呼吸综合征病毒防控策略研究

猪繁殖和呼吸综合征主要是由猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引发,可对仔猪、妊娠母猪、种公猪等造成不同的危害,导致患病猪只表现出严重的呼吸症状,怀孕母猪流产,种猪繁育性能下降等,并且能够造成较高的死亡率,给养殖业带来严重的经济损失。通过对猪繁殖和呼吸综合征病毒和本病的临床症状进行介绍,并提出通过加强饲养、消毒卫生管理、日常疫病监控和免疫接种等几点疫病防控策略,以期降低本病流行所造成的危害。

黔东南地区猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染病例的实验室诊断

【目的】查明黔东南地区部分猪场猪群不明死亡原因,为养殖企业提供治疗思路。【方法】采集病猪血清进行猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学实验室检测。【结果】8个养殖主体猪血清的猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学检测结果均为阳性。【结论】猪圆环病毒2型在8个养殖主体猪场均存在,猪圆环病毒2型除麻江养殖合社外均存在,所检测的5个县(市)有7个养殖主体均存在猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染。

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的控制

2022年2月1日,陕西省某规模化母猪场产房仔猪断尾去势液检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸阳性,该批仔猪于2022年2月23日断奶至下游育肥猪场,猪群断奶后3 d出现咳嗽、少食、发热等临床症状,根据临床症状、剖检大体病理变化、兽医实验室检测结果诊断为猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒2型混合感染。为迅速控制猪群病情,对该猪场免疫程序及保健方案进行调整,并对猪群进行为期18周的猪繁殖与呼吸综合征和圆环病毒2型病毒血症期和抗体水平的持续跟踪发现,紧急防控方案实施后2周大群趋于稳定,猪繁殖与呼吸综合征疫苗二免后10周猪群的病毒血症消失,圆环病毒2型疫苗二免后猪群的病毒血症虽未消失,但阳性率有所下降,猪繁殖与呼吸综合征的抗体水平在猪群二免后8周趋于稳定,猪群受圆环病毒2型疫苗毒株及野毒的双重刺激,抗体衰减规律较为复杂,从持续的跟踪检测分析发现圆环病毒2型疫苗二免后6周抗体水平有所下降,8周后抗体水平上升并持续至该批猪出栏。

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体双重荧光PCR检测方法的建立

为了建立快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重荧光PCR检测方法,本试验根据NCBI数据库中的PRRSV ORF7和Mhp P36基因,分别设计引物和TaqMan探针,通过优化扩增反应条件,建立PRRSV和Mhp的双重荧光PCR检测方法;分析所建立PCR方法的特异性、敏感性和重复性,并初步应用于临床样品检测。结果显示,25μL PCR反应体系中各引物最佳添加量:PRRSV-F 1.5μL、PRRSV-R 1.0μL、PRRSV-P 0.8μL、Mhp-F 1.2μL、Mhp-R 1.3μL、Mhp-P 0.7μL。优化后的PCR反应程序:50℃反转录20 min,95℃预变性2 min,95℃变性5 s,55℃退火10 s,72℃延伸20 s (此处收集荧光),40个循环。建立的双重荧光PCR方法特异性较好,与其他猪常见病原体无交叉反应;检测PRRSV和Mhp的敏感性分别为4.2拷贝/μL和9.6拷贝/μL;批内和批间变异系数均不高于2%,具有很好的重复性。因此,本试验建立的双重荧光PCR方法可同时检测PRRSV和Mhp,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪支原体肺炎(MPS)的诊断和防控工作提供支持。

猪IFN-α8的原核表达及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究

为确定猪干扰素α8(poIFN-α8)蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗病毒作用,合成poIFN-α8基因,克隆入pCSMH大肠杆菌表达载体,将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,进行温度诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳。将表达的目的蛋白利用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱纯化后,采用Western blot试验检测重组poIFN-α8的反应原性,利用猪肺泡巨噬细胞(PAM)检测0.01、0.05、0.1、1 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白对PRRSV的抗病毒活性,并检测重组poIFN-α8蛋白对下游干扰素刺激基因(ISG)Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果表明,成功构建了pCSMH-IFN-α8表达载体,实现了poIFN-α8在大肠杆菌中的包涵体表达,且重组poIFN-α8蛋白具有良好的反应原性;0.05 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白可显著抑制PRRSV在PAM中的复制,poIFN-α8的抗病毒效果显著优于猪干扰素α2(poIFN-α2)、猪干扰素α5(poIFN-α5),且重组poIFN-α8能有效激活ISG的表达。综上,表达的重组poIFN-α8蛋白能有效抑制PRRSV的复制,且能激活ISG的表达。

四川省部分规模养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型感染情况调查

为了解四川省规模化养猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)2种猪免疫抑制类病原的感染情况,采用荧光定量RT-PCR/PCR方法,对898份采自四川省12个地区规模化猪场的组织、精液及血液样品进行PRRSV和PCV2检测与分析。结果显示:至少检出PRRSV和PCV2中一种病原的样品占67.82%,其中组织样品阳性率最高(32.96%),其次为血液(27.17%)、精液(7.68%)。从不同类别样品感染情况看,组织样品中PRRSV+PCV2混合感染率最高,达33.53%;精液样品中PRRSV单感染率最高,达53.00%;血液样品中PCV2单感染率最高,达45.27%。从不同感染类型情况看,PCV2单感染、PRRSV单感染、PRRSV+PCV2混合感染率依次下降,分别为33.18%、20.71%、13.92%;PRRSV单感染、PRRSV+PCV2混合感染率最高的均为组织样品,分别占10.58%、12.80%,PCV2单感染率最高的为血液样品,达22.94%。从不同地区感染情况看,12个地区中PRRSV和PCV2中至少一种病原为阳性的阳性率为52.17%~82.81%,其中绵阳市最高;PRRSV单感染率最高的为绵阳市(37.50%),PCV2单感染率最高的为内江市(44.44%),PCV2+PRRSV混合感染率最高的为乐山市(20.29%)。结果表明:四川省规模化养猪场中普遍存在PRRSV、PCV2单感染和混合感染,其中内江、绵阳、乐山等地的感染情况较为严重;组织样品总阳性率最高并以PRRSV+PCV2混合感染为主,精液和血液样品分别以PRRSV单感染、PCV2单感染为主。

猪繁殖与呼吸综合征的预防及治疗

猪繁殖和呼吸综合征属于一种病毒性传染疾病,会给猪养殖产业的发展造成一定的影响。在临床上,猪繁殖和呼吸综合征病毒不仅会危害仔猪,还会危害种猪,如果仔猪感染到该病毒,会出现呼吸道症状;公猪和繁殖母猪感染该疾病会影响以后的繁殖,严重情况下会失去配种能力。同时,猪繁殖和呼吸综合征病毒会给猪群免疫系统造成一定的危害,导致免疫力低下,产生免疫抑制。在猪群中,该病毒传播快,并不利于整个猪养殖业的发展。因此,应采取有效措施预防猪繁殖与呼吸综合征,并有针对性地进行治疗。

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流感病毒四重PCR检测方法的建立

为了快速、准确检测4种猪呼吸道病毒,根据NCBI GenBank数据库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪流感病毒(SIV)的基因序列,设计4对特异性引物,建立一种能通过扩增片段大小来同时鉴别检测PRRSV(111 bp)、PRV(173 bp)、PCV2(273 bp)、SIV(445 bp)的四重PCR检测方法。特异性试验结果显示,扩增PRRSV、PRV、PCV2、SIV模板均能得到预期特异条带,而扩增灭菌水(阴性对照)、CSFV、JEV不产生任何条带。敏感性试验结果显示,该方法最低病毒核酸检出量分别为PRRSV(6.5×10^(4)copies/μL)、SIV(2.68×10^(5)copies/μL)、PCV2(7.16×10~5copies/μL)、PRV(2.37×10^(4)copies/μL)。用所建立的四重和各单一PCR方法检测45份临床样品,四重PCR的阳性检出率分别为PCV2 22.2%(10/45)、PRRSV 17.7%(8/45)、PRV 4.4%(2/45)、PRRSV+PCV2 13.3%(6/45),四重PCR方法与单一PCR方法的阳性符合率为100%。表明建立的病毒四重PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于上述4种呼吸道病毒的鉴别检测。

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药),探讨其抗PRRSV的作用机制。结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01)。在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05)。金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15。证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系。

猪生殖与呼吸综合征病毒HN／XT／07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立

应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb-A61,McAb-C65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与商品化的PRRSV RT-PCR鉴别试剂盒进行比较。结果显示,McAb-C65与PRRSV美洲株和高致病性PRRSV毒株均呈阳性反应;McAb-A61与PRRSV美洲株呈阳性反应,但不与高致病性PRRSV毒株发生反应;2株单抗都不与欧洲株反应;IFA与RT-PCR的符合率为100%。表明,建立的PRRS间接免疫荧光鉴别诊断方法可为临床高致病性PRRS的确诊提供可靠的验证手段。

猪生殖-呼吸道综合征国内分离毒株的病毒纯化及其结构蛋白分析

本研究主要对猪生殖呼吸道综合征（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ） 国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 进行了病毒纯化及其结构蛋白的分析。选用聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ６０００） 沉淀和差速离心法粗提了经 Ｍａｒｃ１４５ 细胞系增殖的猪生殖呼吸道综合征病毒（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 。并采用非线性蔗糖密度梯度离心法纯化了 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ， 经免疫电镜观察纯化病毒， 发现有较多的胶体金颗粒吸附在直径为４２ ～７８ｎｍ 的病毒粒子周围。经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定纯化病毒的滴度可达１ １６００ 以上， 并利用 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 两种方法对国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 与欧洲型（ Ｌｅｌｙｓｔａｄ） 、美洲型（ Ｖ Ｒ２３３２） 等参考毒株的病毒结构蛋白组成和部分抗原特性进行了初步的研究。测得国内分离毒株主要结构蛋白的分子量为１４５ Ｋ Ｄ，１９２ Ｋ Ｄ 和２６３ Ｋ Ｄ， 并均能被 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的高免血清识别， 这与国外的同类报道很相似。

猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗不同接种途径对母猪生殖道黏膜淋巴细胞分布的影响

16头 5月龄长白×大约克夏二元杂交母猪 ,通过不同途径接种猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)弱毒疫苗 ,采用组织学方法研究其对母猪生殖道黏膜淋巴细胞分布的影响。结果表明 ,与对照组相比 ,鼻腔和肌注接种可使猪子宫角、子宫体和子宫颈黏膜上皮内淋巴细胞的数量极显著增加 (P <0 0 1 ) ,生殖道接种则使淋巴细胞的数量极显著减少(P <0 0 1 )。鼻腔与肌注接种间无明显差异。经生殖道接种疫苗时 ,子宫黏膜上皮变得不规则 ,有些部位上皮变薄。而经鼻腔和肌注接种时 ,黏膜固有层中多见淋巴细胞聚集 ,形成淋巴细胞群 ,并向黏膜腔表面排放。