一例猪嗜血支原体病的诊断及防治

猪嗜血支原体病是由嗜血支原体侵染猪的血红细胞所引发的一种急性热性、高度接触性传染性疾病,临床上患病猪表现为体温显著升高,贫血并出现溶血性黄疸,呼吸频率逐渐加快,体表皮肤发红,严重的可以导致猪衰竭死亡,对生猪养殖业构成的危害极大,该类疾病又被称为附红细胞体病。本次研究结合实际病例,探讨了猪嗜血支原体病的诊断与防治,希望对广大同行有所帮助。

关于猪嗜血支原体病的诊断及防治研究

猪嗜血支原体病是由猪嗜血支原体感染所引发的一种高传染性疾病,属于血液原虫病范畴。猪嗜血支原体病发生后会导致病猪出现高热、贫血、溶血性黄疸、呼吸困难、皮肤发红等症状,又名猪红皮病。当猪感染此病后不及时诊治,会造成病情快速恶化,并且迅速传播,难以抑制。基于此,本文将结合笔者近年来接诊一例典型猪嗜血支原体病进行分析研究,旨在为猪养殖疾病防控提供参考。

一例猪嗜血支原体病的诊断及防治

猪嗜血支原体病是一种严重的传染病,又被称为嗜血支原体病,由猪嗜血支原体感染引起,属于血液原虫病范畴。该病具有急性和热性传染特点,在临床上,病猪常出现发热、贫血、溶血性黄疸、呼吸困难和皮肤发红等症状。如果不及时进行诊断和治疗,病情会迅速恶化,甚至导致病猪死亡。这对于猪养殖业来说是一个严重的威胁。本文旨在全面综述猪嗜血支原体病的流行特点、临床特征、诊断和防治方法,以期为猪养殖一线提供参考。

猪嗜血支原体猪体感染试验

为研究猪嗜血支原体致病机制,将其感染健康猪和切脾猪,从临床症状、血液学和生物化学指标、菌血症、抗体水平以及细胞因子、病理剖检和组织学检查等方面系统研究猪嗜血支原体病的发病过程。结果显示,与不切脾猪相比,切脾猪体内的猪嗜血支原体含量(血液中含量1.0×108拷贝·mL-1)更高,维持时间更长。猪嗜血支原体血液中含量和白细胞计数、血细胞比容、红细胞计数和铁等指标显著相关。仅1头猪产生猪嗜血支原体抗体,3组猪血清中均没有检测到细胞因子IL-4和IFN-γ。本研究复制出猪嗜血支原体病病例,记录了该病的发展过程,为该病的病理机制、预防、诊断等方面的研究奠定基础。

猪嗜血支原体病原染色检测法的比较研究

为检测猪嗜血支原体(M.suis)感染,本研究对传统血涂片吖啶橙染色方法进行改良,建立了快速检测M.suis的血液吖啶橙染色方法。结果显示,血液吖啶橙染色法的染色时间比传统血涂片吖啶橙染色法和姬姆萨染色法分别节省约30 min和1 h。利用血液吖啶橙染色法、血涂片吖啶橙染色法、姬姆萨染色法及PCR法对200份临床血液样品进行检测,结果显示,阳性检出率依次为64.5%、59.5%、48%及68.5%。3种染色方法与PCR的符合率分别为87%、77%、59.5%;与PCR结果相比,前两种染色方法差异不显著(p>0.05),后者差异极显著(p<0.01)。结果表明,血液吖啶橙染色法优于其他两种染色方法,具有操作简单快速、准确度高、检出率高等优点,适用于临床上对M.suis感染快速定性检测和流行病学调查研究。

猪嗜血支原体PCR及荧光定量PCR检测方法的建立和比较

为了解猪嗜血支原体(Mycoplasma haemosuis)对猪群的感染情况并建立该病的检测方法,本研究根据GenBank登录的M.haemosuis 16S rRNA基因序列(FJ263944)设计合成PCR引物以及荧光定量PCR(FQ-PCR)引物和探针。以含16S rRNA基因的重组质粒为模板,通过对PCR反应条件的优化,建立检测M.haemosuis的PCR和FQ-PCR检测方法。结果表明,这两种检测方法均具有较好的敏感性和特异性,与常规方法相比,FQ-PCR方法的敏感性高1 000倍;用这两种PCR方法检测20份临床样品,常规PCR方法的阳性率为60%(12/20),而FQ-PCR方法的阳性率为75%(15/20)。这两种检测方法的建立为确定M.haemosuis在我国猪群的感染情况和建立该病动物模型提供有效的检测手段。

猪嗜血支原体OxaA基因的同义定点突变、克隆及在Vero细胞中的表达

为真核表达猪嗜血支原体(Mycoplasma suis)膜蛋白OxaA基因,本实验采用PCR技术扩增包含OxaA基因全长在内的1 561 bp序列,通过引物突变法对OxaA基因内部的两个编码蛋白障碍的碱基进行同义定点突变,应用Overlap PCR技术将3对引物扩增得到的OxaA片段进行拼接,获得能够正确翻译膜蛋白的OxaA基因序列,将鉴定正确的pVAX-OxaA重组质粒转染Vero细胞,应用IFA和western blot方法鉴定OxaA基因在Vero细胞中的表达。结果显示,突变的OxaA基因经Overlap PCR扩增获得长度为747 bp的基因片段,与GenBank中M.suis基因组的核苷酸序列同源性为98%,IFA检测OxaA基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为29 ku,具有较好的反应原性。本实验首次在真核细胞中表达了M.suis的QxaA基因,为M.suis基因疫苗的研究奠定了基础。

猪嗜血支原体酶标单抗阻断ELISA检测方法的建立

为确定猪嗜血支原体(M.suis)在临床的感染情况和进行流行病学调查提供检测方法,本研究以纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和辣根过氧化酶标记的MSG1蛋白单抗建立了检测猪嗜血支原体的阻断ELISA方法。经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.5μg.mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶1,作用时间为37℃1.5h,酶标单抗最佳稀释度为1∶10 000,作用时间为37℃1h。通过对100份M.suis阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥23.71%时判为阳性,PI≤36.35%时判为阴性,23.71%<PI<36.36%时判为可疑。敏感性、特异性和重复性试验证明该检测方法敏感性高、特异性强、可重复性好,可用于M.suis流行病学调查和疾病诊断。

一种基于16SrRNA基因检测猪嗜血支原体PCR方法的建立

本试验目的是建立一种基于16SrRNA基因检测猪嗜血支原体的PCR方法。根据GenBank上猪嗜血支原体16S rRNA基因(ID:U88565)设计特异引物,对哈尔滨采集病料进行PCR并克隆pMD18-T,测序所扩增的片段为411bp,同源性分析表明,该序列与参考序列同源性97.57%。特异性和敏感性试验表明,所建立的PCR诊断方法对猪肺炎支原体、大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌无交叉反应;血液基因组DNA最小检出量为0.75fg/μL。该方法具有快速、特异、敏感等特点,为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。

猪嗜血支原体ORF9的全基因合成及原核表达

为原核表达猪嗜血支原体(M.haemosuis)ORF9蛋白,本研究根据GenBank登录的AJ504999的ORF9基因序列,采用重叠延伸PCR技术(SOE-PCR),选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成4对寡核苷酸片段,人工合成ORF9基因。将其克隆于表达载体pET-32a中构建重组表达质粒pET-ORF9,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和western blot鉴定表明,重组蛋白的分子量约为34 ku。

新疆阿拉尔垦区猪嗜血支原体PCR检测方法的建立

[目的]掌握阿拉尔垦区猪嗜血支原体的流行现状。[方法]根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列(U88565)设计1对特异性引物,对采自新疆阿拉尔垦区的样品进行PCR扩增,并将其产物克隆到pBR322载体后测序。[结果]扩增出的片段为0.836 kb。同源性分析结果表明,该序列与猪嗜血支原体参考基因组序列同源性为99.47%,反映出我国分离株与国外株基因同源性较高。[结论]建立了一种猪嗜血支原体PCR检测方法,该方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段,并为相关基因的表达及功能研究奠定了基础。

单味中药对猪嗜血支原体黏附红细胞的影响

研究单味中药对猪嗜血支原体(M.suis)黏附红细胞作用的影响,筛选具有抑制M.suis黏附红细胞作用的中药。应用悬滴镜检法、血液直接PCR法筛选M.suis阳性血液和M.suis阴性血液;利用qPCR技术研究单味中药与M.suis阳性红细胞、M.suis、红细胞作用后,红细胞黏附M.suis的拷贝数变化。结果显示,青蒿、黄芩、槟榔、甘草、秦皮、苦参、丹参作用于M.suis阳性红细胞,可极显著降低红细胞黏附M.suis的拷贝数(P<0.01);青蒿、黄芩、槟榔、甘草、秦皮、苦参、丹参作用于M.suis可极显著减少红细胞黏附M.suis拷贝数(P<0.01);青蒿、黄芩、槟榔、甘草作用于红细胞,可极显著抑制红细胞黏附M.suis拷贝数(P<0.01)。结果表明,青蒿、黄芩、槟榔、甘草、秦皮、苦参、丹参可抑制M.suis对红细胞的黏附,可用于预防和治疗M.suis感染和猪附红细胞体病中药的研发。

猪嗜血支原体病研究进展

猪嗜血支原体可引起猪传染性贫血或猪嗜血支原体病,该病原体在世界范围内分布范围广,严重阻碍养猪业的发展。笔者等从猪嗜血支原体病的病原学、致病机理、临床症状、诊断及防制等方面进行综述,拟为该病的研究提供参考。

复方中药对猪嗜血支原体感染预防作用的研究

为研究复方中药对猪嗜血支原体(M.suis)感染的预防效果,将复方中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和强力霉素分别与M.suis阳性血液在细胞培养液中进行培养,间隔12h用qPCR检测培养物中M.suis拷贝数。选取临床健康的35日龄仔猪进行M.suis PCR检测,将50头M.suis PCR阳性仔猪随机分为5组,每组10头,每组隔离饲养。三个复方中药组采用拌料方式连续喂服7d,强力霉素组拌料喂服5d,对照组饲料中不添加任何药物。分别于用药前、用药后第10、20、30天前腔静脉采血,对血液M.suis拷贝数、红细胞SOD活力、红细胞膜ATP酶(Na+K+-ATPase、Ca2+Mg2+-ATPase)活力、淋巴细胞(T、B)增殖率、血清IgG含量进行检测。结果显示,三种复方中药在体外培养时均可极显著降低培养物中M.suis拷贝数(P<0.01);在仔猪预防试验中,与对照组和强力霉素组相比,复方中药Ⅰ可以极显著降低血液中M.suis拷贝数(P<0.01),提高红细胞SOD活力与B淋巴细胞增殖率(P<0.05或P<0.01);复方中药Ⅱ可以提高红细胞SOD活力、Na+K+-ATPase活力与淋巴细胞增殖率(P<0.05),但无法长时间抑制M.suis生长;复方中药Ⅲ可以极显著降低血液中M.suis拷贝数(P<0.01),显著提高红细胞SOD活力(P<0.05)。结果说明:复方中药Ⅰ对M.suis自然感染有良好的预防作用。

猪嗜血支原体诊断方法的比较

[目的]建立猪嗜血支原体的PCR诊断方法,并与常规染色镜检诊断方法进行比较。[方法]对采自新疆阿拉尔垦区的疑似样品分别采用吖啶橙、姬姆萨染色镜检,采用温度法将嗜血支原体从红细胞上解离下来,提取其基因。根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列(U88565)设计1对特异性引物,进行PCR扩增,建立猪嗜血支原体的PCR诊断方法。[结果]比较了3种诊断方法,指出了各自的优劣。所建立的PCR方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新手段。

新疆阿克苏地区猪嗜血支原体感染血清流行病学调查

为了深入研究新疆阿克苏地区猪嗜血支原体的感染状况,通过双抗原夹心法对新疆阿克苏地区8个猪场的共530份猪血清进行了测定,并分析了不同区域、季节以及年龄段猪感染嗜血支原体的情况。结果显示,所有猪只血清的总阳性率为12.54%。其中沙雅县猪血清阳性率最高(17.20%),阿克苏市最低(10.00%);新和县、乌什县、柯坪县、阿瓦提县、温宿县和库车市猪血清阳性率分别为11.53%、10.81%、13.64%、13.80%、10.71%和12.90%;该病全年均有感染,夏季感染率最高(15.20%),冬季最低(8.65%);母猪血清阳性率最高(13.46%),其次是育肥猪(12.50%),仔猪最低(10.00%)。该病感染范围较广,对阿克苏地区养猪业造成较大经济损失,通过抽样调查,可为阿克苏地区对该病的有效防治提供参考。

云南某地区猪嗜血支原体的诊断及生物信息学分析

为了解云南某地区的猪嗜血支原体病的流行情况。采用血液涂片镜检、PCR鉴定、同源性比对与遗传进化分析。结果云南某地区猪嗜血支原体的感染率为2%;同源性比对与E.suis的同源性在97.2%~96.9%;遗传进化与U88565、AF029394为同一分支,亲缘关系较近,说明云南某地区存在猪嗜血支原体流行,这为该病的治疗提供科学依据。

血液直接PCR方法在猪嗜血支原体检测中的应用

为临床上能快速准确检测猪嗜血支原体感染,建立了一种检测猪嗜血支原体的血液直接PCR方法。该方法能特异性地扩增猪嗜血支原体16SrRNA基因中的一段396bp序列,而对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等没有扩增到目的条带;该方法能检测到每微升抗凝血中猪嗜血支原体的最低拷贝数为5.52×101 copies,与常规PCR相当;应用血液直接PCR和常规PCR对100份抗凝血样进行检测,阳性检出率分别为65%和69%,差异不显著(P>0.05)。结果表明,血液直接PCR方法具有良好的特异性、较高的灵敏度和较快的检出速度,适用于临床上对猪嗜血支原体感染进行快速确诊和流行病学调查。

猪嗜血支原体的病原学研究进展

为了给深入研究猪嗜血支原体提供帮助,综述了猪嗜血支原体的病原生物学特征、流行病学特点和致病机理,归纳了猪嗜血支原体检测技术的研究进展,指出猪嗜血支原体免疫制剂的研究将获得重大突破。

我国部分省份猪嗜血支原体感染血清流行病学调查

为研究猪嗜血支原体在猪群中的感染情况,本研究采用阻断ELISA方法对来自我国7个省(区)的1 492份猪血清进行了检测,并对其感染的时间、空间和种群间的分布进行了分析。结果表明:血清总阳性率为17.36%,其中上海地区最高为57.01%,广西地区最低为4.55%,安徽、浙江、江苏、江西和四川分别为28.40%、20.25%、13.93%、7.14%和5.49%。感染时间从6、7月份开始,9月份感染比例达到最高(33.94%),然后开始慢慢下降。种群间分析显示,母猪血清阳性率为65.48%,仔猪为4.8%。血清流行病学调查结果显示猪嗜血支原体在我国猪群的感染比较普遍,而且呈现出逐年增加的趋势,应该引起足够的重视。