猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定

[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。

猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测

【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein,Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考依据。【方法】本研究对2019-2021年于湖南省6个地区收集的17份PCV2阳性组织样品进行PCV2全基因组序列扩增及测序分析,绘制系统进化树,利用生物信息学方法分析Cap蛋白氨基酸变异情况,并预测CTL表位。【结果】系统进化树显示,获得的17株PCV2全基因组序列中,1株PCV2a、7株PCV2b和9株PCV2d。Cap蛋白氨基酸序列比对分析发现,共有16个氨基酸残基突变位点位于病毒Cap蛋白表面,且有11个突变位点参与构象型表位的形成。此外,共预测出9个PCV2 Cap蛋白潜在的CTL表位,其中4个表位(16-24、28-36、136-144和179-187位氨基酸)在GenBank的1610株PCV2不同基因型毒株中高度保守。通过TCR-pMHC复合物3D结构对4个保守性表位进一步分析,结果显示,这4个肽段均能与MHCⅠ分子和TCR形成稳定的TCR-pMHC复合物。【结论】本研究结果表明,PCV2b和PCV2d为当前湖南省主要流行的基因型,且表现出高度变异;预测的CTL表位可作为候选抗原表位。

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析

猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2 Cap基因和SEZ疫苗株ST171 Szp基因的上下游同源臂基因(Szp-up、Szp-down),将上述PCR产物分别与pMD19-T载体连接,分别构建重组质粒pMD19-T-Cap、pMD19-T-Szp-up和pMD19-T-Szp-down。将pMD19-T-Szp-up与pG+host5分别双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp-up;将pMD19-T-Szp-down与pG+host5-Szp-up分别经双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp。上述重组质粒均经酶切和测序鉴定正确后分别经BamH I酶切pG+host5-Szp载体和pMD19-T-Cap载体后构建重组载体pG+host5-PCV2-Cap-Szp,并使PCV2 Cap基因替换Szp基因的166 bp~783 bp。经酶切和测序鉴定正确后将该质粒电转化ST171感受态细胞,通过红霉素抗性板筛选重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株。通过菌落计数分别绘制PCV2-Cap-Szp/ST171及其亲本菌株ST171的生长曲线;分别采用荧光定量PCR(qPCR)检测重组菌株Cap基因以及亲本菌株ST171 Szp基因的转录水平;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定重组菌株Cap蛋白的表达。结果显示,亲本菌株和重组菌株的生长曲线基本一致,重组菌株中Cap基因的转录水平与亲本菌株中Szp基因的转录水平相当,且其中的蛋白肽段与PCV2 Cap蛋白的肽段相符,表明插入Szp基因不影响ST171的生长特性,且重组菌中的Cap基因可以正常转录并能够表达Cap蛋白。分别经小鼠腹腔接种不同剂量的重组菌株及亲本菌株,并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算两株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,重组菌株及亲本菌株对小鼠的LD50分别为3.21×108 cfu/mL及2.0×10^(7) cfu/mL,虽然前者对小鼠的LD50有所升高,但其对小鼠的致病性并未增强。将重组菌株及亲本菌株灭活乳化后与商品化的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠,0.5 mL/只,二免后14 d采用间接ELISA检测各组小鼠血清中的Cap蛋白抗体水平,结果显示,免疫亲本菌株及PBS对照小鼠均未产生PCV2 Cap蛋白特异性抗体,而重组菌株刺激小鼠产生的Cap蛋白抗体水平极显著高于PCV2商品化疫苗(P<0.001)。将上述3株菌按照上述方法分别经腹腔免疫小鼠。二免后14 d经腹腔以0.5 mL 1×106 cfu/mL的SEZ C55138株攻击,观察记录小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线;将重组菌株和亲本菌株按照上述方法免疫小鼠,二免14 d后经腹腔接种0.2 mL 1×108拷贝/mL的PCV2。分别于攻毒后不同时间采血,采用qPCR检测各组小鼠血清中的病毒载量。SEZ C55138株攻毒结果显示,免疫ST171与PCV2-Cap-Szp/ST171的小鼠均未出现临床症状和死亡,存活率达100%;而两个阴性对照组小鼠攻菌后均表现出相应临床症状,并相继死亡,死亡率分别为70%和80%。PCV2攻毒实验结果显示,与免疫ST171组小鼠相比,免疫重组菌株的小鼠在攻击PCV2后1 d、3 d和5 d小鼠血清中的病毒载量均有所降低。上述结果表明,本实验构建的重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171能够诱导免疫小鼠产生高水平的体液免疫反应,并保护小鼠免受致病性SEZ的伤害及减少PCV2攻毒后小鼠血清中的病毒载量,本研究为细菌活载体疫苗及PCV2和SEZ二联疫苗的研发奠定基础。

猪圆环病毒2a型和2b型Cap蛋白的原核表达及鉴定

为制备猪圆环病毒2a型(PCV2a)和2b型(PCV2b)Cap蛋白,用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至pET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株,通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果显示:重组PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的分子量约为30 kDa,在不同温度下都以包涵体形式存在,在37℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达的Cap蛋白表达量最高。试验成功制备了PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白,为制备PCV2二价疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。

猪圆环病毒3型Cap重组鞭毛蛋白融合表达及其免疫原性研究

【目的】利用重组杆状病毒系统表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)Cap重组鞭毛蛋白并研究该蛋白的反应原性和免疫原性,为开发PCV3亚单位疫苗提供数据支持。【方法】通过对Cap基因进行最适密码子优化并与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因Flagellin进行融合后克隆到pFastBac TMⅠ载体。通过Bac-to-Bac系统,筛选获得重组Cap-Flagellin杆状病毒,利用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blotting鉴定重组杆状病毒,将重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠评价其免疫原性。【结果】重组Cap-Flagellin杆状病毒在Sf9细胞中能有效表达重组蛋白,SDS-PAGE检测可见68 ku的目的条带。IFA结果显示,重组Cap-Flagellin杆状病毒感染后72 h在Sf9细胞膜及胞浆中均出现绿色特异性荧光;Western blotting分析表明,重组蛋白能与PCV3阳性血清发生特异性反应,表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,与Cap杆状病毒组相比,重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠2l和28 d后可诱导产生更高水平的Cap特异性抗体(P<0.05;P<0.01),且Cap-Flagellin杆状病毒组小鼠脾细胞白细胞介素-8(IL-8)细胞因子水平显著或极显著高于其他组(P<0.05;P<0.01),表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的免疫原性。【结论】本研究利用杆状病毒表达系统成功表达了PCV3 Cap重组鞭毛蛋白,并证实其具有良好的生物学活性,为PCV3亚单位疫苗的开发研制奠定了基础。

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶2048000、1∶512000、1∶1024000、1∶512000、1∶1024000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为λ型,仅1D2轻链为κ型。Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应。IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,1D2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证。重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL。采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%。免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础。

利用SUMO系统高效表达可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白

利用pCold-SUMO可溶性原核表达载体,构建表达猪圆环病毒2型缺失核定位信号肽的Cap基因的重组表达载体pCold-SUMO-dCap,并将其转入Arctic-Express表达菌株中15℃低温诱导表达.表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明SUMO-dCap融合蛋白获得了高效表达,可溶性SUMO-dCap融合蛋白约占总融合蛋白的50%;用NI-NTA树脂纯化可溶性的融合蛋白,然后利用SUMO蛋白酶特异性去除SUMO标签,从而得到不含任何标签的dCap蛋白,进一步的Western-blot分析表明,表达的dCap蛋白具有良好的反应原性.

猪圆环病毒2型Rep/Rep'和Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护性试验

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制备亚单位疫苗及PCV2灭活苗,分组免疫BALB/c鼠进行攻毒,以评价疫苗的免疫保护力。对PCV2-rRep和-rRep'亚单位疫苗免疫鼠血清ELISA抗体检测表明,于免疫后第14 d抗体全部转阳,第35 d抗体效价分别达到1∶42 667和1∶51 200。PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫组于第21 d抗体转阳,第35 d抗体效价分别达1∶2 133和1∶333。攻毒试验表明,PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠获得完全保护;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫组无保护作用。血清中和试验表明,PCV2-rCap蛋白亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠血清中和抗体效价达1∶1 600和1∶800;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫鼠血清无中和病毒能力。该研究表明,PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫保护力,可以与PCV2自然感染猪产生的抗Rep蛋白抗体相鉴别,具有良好的开发前景。

猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0mmol.L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法。结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg.mL-1;血清最佳稀释度为1∶40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1h;血清反应时间为37℃30min;酶标二抗最适作用时间为37℃45min;底物最佳反应条件为37℃显色15min。用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2ELISA试剂盒得到的结果基本一致。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2。将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础。

猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建及表达

根据PCV2 Cap蛋白基因的序列设计引物,从1份患PMWS仔猪组织病料中扩增出Cap蛋白基因(702 bp)。并利用基因工程技术将Cap蛋白基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,将其与腺病毒骨架载体(pAdeasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过免疫荧光、PCR和Western blot检测证明PCV2 Cap蛋白基因在293细胞内获得表达。

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达

用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。

猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。