猪圆环病毒Ⅰ型全基因组的克隆及生物信息学分析

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是引起临床断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原之一,而与之遗传相关的猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)无致病性。本研究从病猪的脾脏通过PCR扩增并成功克隆了PCV1的全基因组,在此基础上,对GenBank中发表的所有31株PCV1以及部分PCV2(60株)进行了生物信息学分析。PCV1株间遗传与分子进化分析结果表明:PCV1可分为基因Ⅰ型与基因Ⅱ型两种基因型。PCV1与PCV2之间基因组结构和功能区分析结果表明:PCV1和PCV2基因组之间在复制起始区等功能区高度保守,在主要的编码区,尤其是编码Cap蛋白的ORF2,存在着许多差异。

猪圆环病毒I型荧光定量PCR检测方法的建立

以定量的10倍系列稀释的质量pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增，建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法。结果表明该方法检测灵敏度可达1．0×10^4拷贝／μL，线性范围为10^10～10^1；对起始浓度为1．0×10^2、1．0×10^6、1．0×10^6拷贝／μL的标准品的最终实际测得值分别为1．001×10^7、0．869×10^6和0．988×10^5拷贝／μL，变异系数分别为4．758％、1．865％和3．836％，说明此方法具有良好的准确性和重现性。对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR，与套式PCR（nPCR）具有相近的灵敏度。

猪圆环病毒I型ORF2蛋白序列与其核定位功能的相关性

软件分析PCV1-ORF2的核苷酸序列发现其N端的氨基酸序列中包含一段核定位序列,将具有核定位序列特征的区域删除,构建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,同时构建PCV1-ORF2全基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,分别转染Hela细胞,可观察到后者绿色荧光聚集在细胞核区域;而前者转染Hela细胞结果显示核定位现象消失,从而可以推断这一区域是CPV1-ORF2蛋白核定位的功能区。

猪圆环病毒1型微滴数字PCR定量检测方法的建立

以猪圆环病毒1型ORF1基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法。对ddPCR反应中的探针浓度进行了优化。结果显示:ddPCR反应中的最佳探针浓度为250nmol/L;ddPCR方法线性相关系数(R2)为0.999,呈良好的线性关系;检测限为7.8copies/20μL;变异系数为2.7%;与其他病毒无交叉反应。通过对临床样品的检测,检测结果与实时荧光PCR结果一致。结果表明:新建立的ddPCR方法敏感性高、特异性强,可用于猪圆环病毒1型的定量检测。