鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

2020—2022年安徽省猪圆环病毒2型和3型流行情况调查

为了解安徽省猪圆环病毒病(PCVAD)流行情况,2020—2022年于安徽省13个定点监测点采集950份病原学样品和650份血清学样品,采用荧光PCR方法进行猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病原检测,采用间接ELISA方法进行PCV2抗体检测。结果显示:安徽省PCV2抗体阳性率逐年升高,大型养殖场的抗体阳性率显著高于中、小型养殖场(P<0.05);PCV2病原阳性率呈下降趋势,PCV3呈上升趋势,且同一年份的PCV2病原阳性率均显著高于PCV3(P<0.05);屠宰场的PCV2和PCV3病原阳性率均显著高于养殖场(P<0.05);大型养殖场的PCV2和PCV3病原阳性率均显著高于小型养殖场(P<0.05)。结果表明:安徽省PCVAD防控取得一定成效,但是PCV2仍存在广泛感染,PCV3愈加流行,屠宰场和大型养殖场感染风险高。建议持续做好PCV2免疫工作,加强屠宰场的风险监测及大型养殖场的饲养管理和生物安全管理,严防PCV2和PCV3在养殖和屠宰环节流通传播。

猪圆环病毒2型疫苗及其效力评价方法比较研究

为探索对不同猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)疫苗产品进行统一质量评价的可行性,对国内该类疫苗产品及其现有效力评价方法进行了归纳和比较研究。结果发现,目前猪圆环病毒2型疫苗类产品种类有25个,且疫苗毒株数量多达10余个,效力检验方法包括传统的免疫攻毒法、血清学方法和多种不同的替代方法,但尚没有统一的效力评价体系。本研究可为进一步完善PCV2疫苗效力评价方法、统一评价疫苗效力、提高产品质量提供参考。

2017年~2023年河南省猪圆环病毒2型的流行调查及遗传变异分析

为了解河南省猪圆环病毒2型(PCV2)的流行及变异情况,本研究采集该地区规模化猪场2017年1月~2023年6月939份表现为繁殖障碍和呼吸道症状的病猪血液或组织样品,采用PCR方法进行PCV2检测。结果显示,PCV2总阳性率为31.42%(295/939);2017年~2022年PCV2阳性率逐年降低,分别为58.65%(61/104)、49.48%(48/97)、28.57%(36/126)、16.15%(31/192)、11.52%(19/165)和7.87%(7/89),而2023年迅速上升,达到56.02%(93/166)。利用PCR扩增29份PCV2阳性样品的全基因组序列并测序,采用Meg Align分析PCV2流行株全基因组序列与Gen Bank中4株PCV2参考株全基因组序列的同源性;采用MEGA 11软件利用NJ法构建PCV2流行株ORF2基因与Gen Bank中24株PCV2参考株ORF2基因的系统发育树;采用Meg Align分析PCV2流行株Cap蛋白氨基酸序列的变异特征;采用RDP4和Sim Plot分析PCV2流行株全基因组的重组特征。全基因组同源性分析结果显示,本研究鉴定的PCV2全基因组序列之间的同源性为95.1%~100%,与PCV2参考株的同源性为93.7%~98.6%,其中与疫苗株PCV2a LG(HM038034)、PCV2b DBN-SX07-2(HM641752)和PCV2d SH(AY686763)的同源性分别为94.8%~96.2%、95.3%~98.6%和96.6%~97.8%,与来自丹麦的代表株PCV2c DK1980PMWSfree株(EU148503)的同源性为93.7%~95.1%。此外,两株2023年的PCV2流行株HN230522和HN231217与参考株的同源性仅为94.5%~97.9%。进化树结果显示,有19株PCV2流行株与PCV2d基因型参考株聚为一个分支,10株与PCV2b基因型参考株聚为一个分支。其中今年出现的PCV2流行株HN230522和HN231217株虽然属于PCV2d基因型,但处于一个相对独立的分支。Cap蛋白氨基酸序列分析结果显示,与疫苗株PCV2a LG(HM038034)、PCV2b DBN-SX07-2(HM641752)和PCV2d SH株(AY686763)相比,部分PCV2流行株在构象表位区(aa47~aa85和aa165~aa200)存在R^(48)H、A^(59)K/R、G^(85)D、P^(151)T、N^(178)S、R^(180)K和G^(197)S的突变,在基因型特异性结构域(aa190~aa191/aa206/aa210)存在K^(206)I的突变,且HN230522株在核定位信号区(NLS)(aa1~aa41)存在特有的V^(30)L突变,HN231217株在基因型特异性结构域(aa89~aa91)存在特有的^(89)RTV^(91)残基。重组分析结果显示,有高达65.52%(19/29)的PCV2流行株存在疑似的重组片段,且重组片段全部位于ORF1中。上述结果表明,今年以来河南省猪场PCV2阳性率快速上升,且流行株出现了较大变异,应加强对PCV2流行动态和遗传变异的监测。本研究为河南省PCV2分子流行病学、疫苗研究提供了参考依据。

密码子优化和信号肽对猪圆环病毒ORF2基因在毕赤酵母表达中的影响

为了在毕赤酵母中高效表达PCV2ORF2基因,对PCV2ORF2基因编码的187个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏爱性优化,利用两步PCR全化学合成优化后的ORF2基因。将优化前后的PCV2ORF2基因片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,构建重组质粒pPICZα-C-ORF2和p PICZα-C-ORF2op。将线性化的重组质粒电转化毕赤酵母GS115,并筛选Zeocin抗性重组子。同时,也研究了信号肽对PCV2ORF2表达效率的影响。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,只有经密码子优化且去除ORF2基因自身信号肽的重组子能够分泌表达PCV2 ORF2蛋白,目的蛋白分子质量约为30 ku,表达的重组ORF2蛋白可被PCV2阳性血清识别,具有生物学活性。

广西壮族自治区猪圆环病毒2型(PCV2)分子流行病学调查及遗传变异分析

[目的]了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在广西壮族自治区的流行情况及遗传特征。[方法]采用PCR方法对广西壮族自治区不同地区送检的病料进行PCV2检测和全基因组序列扩增。应用BioEdit、Mega 7.0、RDP 5和SimPlot(ver 3.5.1)软件对获得的24株PCV2毒株全基因组序列进行核苷酸序列相似性、遗传变异和重组分析,并对Cap蛋白氨基酸序列变异位点进行分析。[结果]PCV2广西株基因组大小均为1768 bp;核苷酸序列相似性分析显示,广西株与参考株PCV1~PCV4的相似性在44.7%~99.7%,与PCV3亲缘性最低;广西株为PCV2b和PCV2d型,PCV2d流行最为广泛;全基因组序列重组分析显示,部分广西株存在重组事件;与疫苗株AY686764-PCV2b和HM641752-PCV2b相比,PCV2广西株的Cap蛋白氨基酸序列共有21个位点发生变异。[结论]PCV2广西流行毒株以PCV2d型为主,部分毒株具有重组现象,部分位点发生独特的氨基酸变异,遗传进化趋势明显。研究结果为广西壮族自治区PCV2的流行病学调查和遗传进化特征分析提供了基本数据。

水栀子多糖提取物对感染猪圆环病毒2型的RAW264.7细胞氧化应激的调节作用研究

为了研究水栀子多糖提取物(Gardenia jasminoide var.radicans polysaccharide extract,GJPE)对猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的RAW264.7细胞氧化应激的调节作用,试验采用ELISA法测定了GJPE对RAW264.7细胞的安全浓度;将RAW264.7细胞分为空白对照组、维生素C组、不同浓度(安全浓度范围)GJPE组,分别加入到96孔细胞培养板(1×10^(6)个/mL)和24孔细胞培养板(2×10^(5)个/mL)中,除空白对照组加基础培养基外,其他各组分别加入1×10^(3)TCID_(50)PCV-2病毒液,并设置PCV-2组(只添加PCV-2病毒液)作为病毒对照组,100μL/孔(96孔细胞培养板)或500μL/孔(24孔细胞培养板),培养24 h;吸弃上清液,用PBS洗涤3遍,空白对照组和PCV-2组分别加入基础培养基,维生素C组加入200μmol/mL维生素C,不同浓度GJPE组分别加入相应浓度GJPE[100μL/孔(96孔细胞培养板)或500μL/孔(24孔细胞培养板)],培养24 h。收集96孔细胞培养板中的细胞用CCK-8测定细胞活性;收集24孔细胞培养板中的细胞检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、细胞内氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide,GSSG)含量及黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的活性,收集细胞培养上清液检测一氧化氮(NO)含量。结果表明:GJPE对RAW264.7细胞的安全浓度范围为0~400μg/mL。与空白对照组相比,PCV-2组RAW264.7细胞活性、GSH含量显著降低(P<0.05),ROS水平和NO、GSSH含量及XOD、MPO、iNOS活性极显著升高(P<0.01);与PCV-2组相比,GJPE400组的细胞活性及GSH含量显著提高(P<0.05),ROS、GSSH含量极显著降低(P<0.01),NO含量和XOD活性显著降低(P<0.05),MPO和iNOS活性极显著降低(P<0.01);GJPE100组和GJPE200组ROS水平显著降低(P<0.05),GJPE200组GSSH含量显著降低(P<0.05)。说明GJPE能增强细胞活性,提高感染PCV-2的RAW264.7细胞的抗氧化能力,有利于缓解病毒感染引发的细胞氧化应激。

猪瘟病毒和猪圆环病毒2型引起猪免疫抑制的研究进展

猪瘟病毒和猪圆环病毒2型主要侵害猪的免疫系统,使机体免疫力降低,给养猪业带来巨大的经济损失,目前对该病尚无有效治疗方案,疫苗免疫仍是主要的防控途径。因此,开展猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的免疫学致病机制研究具有十分重要的意义。论文综述了猪瘟病毒和猪圆环病毒2型通过引起免疫细胞数量减少、免疫细胞和器官损伤、免疫相关因子和细胞因子表达失衡以及免疫检查点分子过表达等方面造成机体淋巴细胞衰竭和免疫抑制的相关研究进展,为猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的科学防控提供理论依据。

保育仔猪猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊疗

为查清山西省吕梁市中阳县某猪场从山东购买的保育仔猪大量出现的急性死亡、关节发炎、呼吸困难、高热等症状的病原,无菌采集病猪并带回实验室进行临床剖检,随后采集血液、淋巴结、肺、肾脏和脾脏进行实验室诊断,做出初步判断,制定综合防治策略,病情得到控制。本研究采用灵敏度和准确度较高的实时荧光PCR技术定性检测病料样品中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和副猪嗜血杆菌(HPS)。结果表明:中阳县某猪场保育仔猪为PCV2与HPS混合感染。基于诊断结论对保育猪免疫治疗程序和消毒进行合理调整,综合防治13 d后,猪群无新增发病率和新增死亡率,最大程度地减少了经济损失。本研究为猪场后续的治疗与预防提供了诊断依据。

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立

Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(PCV2)的主要结构蛋白,构成病毒的核衣壳,是PCV2的主要免疫保护性抗原,在PCV2血清学诊断中具有重要意义。本研究根据PCV2的ORF2基因序列设计特异性引物,通过PCR方法扩增得到去核定位信号肽的ORF2基因,并通过同源重组将其克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,经测序鉴定成功获得重组质粒pCold-Ⅰ-Cap。将重组质粒转化至感受态细胞BL21中进行表达,通过考马斯亮蓝染色以及免疫印迹试验检测Cap蛋白的表达,同时将纯化后的重组蛋白通过优化反应条件建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组去核定位信号肽Cap蛋白可溶性表达且可以与PCV2阳性血清特异性结合,通过探索不同蛋白包被浓度以及不同一抗孵育浓度初步建立了间接ELISA检测方法,进而为PCV2抗体的有效监测奠定基础。

2020-2021年我国规模化猪场猪圆环病毒2型和3型的分子流行病学调查分析

采集13个省市自治区的491个规模化猪场的1447份疑似猪圆环病毒感染样本,通过荧光定量PCR方法进行猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的检测。分别随机选取50份PCV2和PCV3阳性样品,对其ORF2基因进行测序并分别进行核苷酸同源性比对和遗传进化分析。结果显示,样本中PCV2和PCV3检出率分别为29.16%(422/1447)和18.93%(274/1447)。规模化猪场中PCV2和PCV3检出率分别为47.05%(231/491)和15.68%(77/491),PCV2和PCV3混合感染率为23.81%,混合感染高于单一感染,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪肺炎支原体(MhP)等病原体以多种组合的混合感染形式出现。50个PCV2序列与16个参考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为75.6%~100%和83.1%~99.1%,PCV3对应同源性分别为95.9%~100%和96.3%~100%。分子遗传进化分析显示PCV2d占80%(40/50),PCV2a占4%(2/50),PCV2b占16%(8/50),未检测到PCV2c和PCV2e。PCV3a、PCV3b和PCV3c分别占28%(14/50)、22%(11/50)和50%(25/50)。表明2020-2021年我国规模化猪场PCV2的主要流行基因型是PCV2d,其次为PCV2a和PCV2b。PCV3c为我国规模化猪场中的主要流行基因型,而PCV3a和PCV3b流行率也依然较高。论文对我国猪圆环病毒的分子流行病学进行了数据补充,对临床防控起到了预警作用,也为猪圆环病毒疫苗的研发提供参考。

猪圆环病毒2型感染性克隆构建

基于PCV2滚环复制原理,在分析PCV2不同基因亚型代表毒株基因组结构和序列的基础上,设计2对引物用于PCR扩增PCV2基因组序列。以从收集到的疑似PCV2感染的10份猪血清样品中提取的DNA为模板,用设计的引物扩增目的片段,并进行测序分析,1株为PCV2a型,4株为PCV2b型,5株为PCV2d型。每种基因型毒株中各选取一个样本,利用上述2对引物进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pEASY-Blunt simple载体中,通过双酶切连接2个PCR片段,构建含有约1500 bp重叠序列的PCV2基因组的质粒。通过脂质体转染法将含PCV2全基因组的质粒转染至PK-15细胞进行病毒拯救,经PCR和IFA两种方法验证,证明成功拯救出3个基因型的PCV2毒株。通过对PCV2全基因组结构及序列分析,该方法同样适用于PCV2g、PCV2h基因型病毒的感染性克隆构建。本研究建立了一种基于反向遗传学技术的PCV2感染性克隆的构建方法,为开展PCV2的病原学研究提供了技术支持。

2022-2023年新疆部分地区猪圆环病毒2型抗体检测及分析

研究旨在了解2022—2023年新疆部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的抗体水平,以期为该病的科学防控提供参考。试验采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对来自3个地区11个猪场的296份血清样品进行PCV2抗体检测。结果显示,PCV2抗体平均阳性率为85.47%(253/296),高于国家规定标准(70%);在调查的11个规模化猪场中,除A场和C场的PCV2抗体水平未达到国家规定标准外,81.82%(9/11)的猪场PCV2抗体水平均达到群体免疫的抗体水平和免疫标准。研究表明,新疆地区猪场PCV2的整体免疫效果较好,但部分猪场的PCV2抗体水平较低,需要对现有免疫程序进行调整和完善,确保各猪群健康。

2023年成都地区猪圆环病毒3型流行病学调查及遗传进化分析

【目的】调查分析成都地区猪圆环病毒3型(PCV3)的流行与分子遗传进化情况。【方法】试验于2023年1月至2023年12月从成都地区4家无害化处置场采集病死猪组织样品2113份,采用实时荧光定量PCR法检测病料组织PCV3感染情况。设计3对引物对阳性样品的PCV3基因组序列进行PCR扩增并测序。通过在线软件拼接PCV3基因组序列、截取ORF2基因序列并推导其氨基酸序列(Cap),进行相似性比对并构建遗传进化树,分析Cap氨基酸序列突变情况。【结果】组织病料检测结果显示,2113份病死猪组织样品的PCV3阳性率为27.21%(575/2113)。根据PCR扩增测序结果拼接获得了15株PCV3基因组序列。相似性比对分析显示,15株PCV3核苷酸序列相似性为97.2%~100%,ORF2基因核苷酸序列相似性为97.2%~100%,Cap氨基酸序列相似性为96.7%~100%。遗传进化树结果显示,12株PCV3属于PCV3a亚型,3株属于PCV3c亚型。15株Cap氨基酸序列中共13株发生了突变,共存在13个突变位点。【结论】成都地区PCV3主要为PCV3a和PCV3c亚型,基因组相似性高,序列较保守,Cap氨基酸突变位点主要集中在抗原表位。本试验结果提示该地区需制定科学的防控政策,防止病毒蔓延。

猪圆环病毒2型疫苗的应用和研发进展

猪圆环病毒2型(PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原,感染后会导致猪淋巴系统功能衰竭和免疫抑制,严重危害养猪业的正常生产。近年来,PCV2疫苗的研发一直备受关注,相关研究已取得一定进展,已上市了多种疫苗,包括灭活疫苗、亚单位疫苗、嵌合疫苗和合成肽疫苗等。此外,研究人员还在疫苗的免疫机制和接种策略方面进行了深入探讨,为疫苗的研发和应用提供了重要的理论支持。然而,目前PCV2疫苗的研究仍面临着诸多挑战,如临床流行的主要毒株从PCV2b逐渐转变为PCV2d,疫苗安全性、长期免疫效果等,现有疫苗的免疫效果仍需进一步研究证实。本文对PCV2及其现有疫苗的生产现状、新型疫苗的研发进展、佐剂在疫苗中的应用、疫苗对不同基因型的保护能力等进行了综述,以期为我国有效防控PCVAD提供科学参考。

猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

为了制备猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)Cap蛋白单克隆抗体,试验将Cap基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,将获得的重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)用IPTG进行诱导后表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;将纯化后的重组蛋白于皮下免疫Balb/c小鼠,免疫结束后测定免疫小鼠血清效价,当小鼠血清抗体效价达到1∶100000时进行细胞融合;采用有限稀释法进行亚克隆,筛选能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性杂交瘤细胞株,鉴定杂交瘤细胞株抗体亚类,并选择1株抗体效价最高的细胞株再次注射到小鼠腹腔中(5×10^(5)个/只),取腹水采用亲和层析法对单克隆抗体进行纯化;采用间接ELISA方法测定单克隆抗体效价并检测其特异性,分别采用Western-blot和间接免疫荧光试验检测单克隆抗体的反应性。结果表明:PCR扩增得到大小为708 bp的Cap基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-Cap;重组表达菌pET28a-Cap/BL21(DE3)经诱导后表达的重组蛋白可与His标签抗体发生特异性反应,纯化后的重组蛋白在预期位置(31.7 ku)出现清晰的单一条带;共筛选出8株能够稳定分泌抗体且抗体效价高的阳性单克隆细胞株(1E5、2A9、3C6、4B3、5F7、6D11、7A2、8G1株),抗体亚类鉴定均为IgG1亚类。其中7A2株抗体效价最高,用于单克隆抗体的制备;间接ELISA方法证实7A2株单克隆抗体仅与PCV-2 Cap蛋白发生反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)不发生反应;Western-blot和间接免疫荧光试验均证实PCV-2 Cap蛋白可被7A2株单克隆抗体特异性识别。说明本试验成功制备出具有高纯度、强特异性、良好反应性的PCV-2 Cap蛋白单克隆抗体。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。

猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒2型混合感染病例分析

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y syndrome,PRRS)又称为猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种高度传染性疾病,对所有年龄段和所有品种的猪易感。病毒感染可引起母猪乏情、返情、屡配不孕等现象;妊娠母猪流产、早产、产死胎和木乃伊化比例增加;仔猪和育肥猪出现严重的呼吸道症状;公猪性欲减退、精液质量降低等症状。