猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备

为了制备猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒,根据GeneBank上公布的PCV2d亚型HB-MC1株的序列和大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2d亚型ORF2基因,克隆到原核表达载体pET30a(+),获得重组表达质粒pET30a-Cap2d,将该质粒转化入Rosetta(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析,利用Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫原性,并利用电镜技术鉴定重组Cap2d蛋白形成的病毒样颗粒。SDS-PAGE结果表明PCV2d的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达;电镜下观察超声破碎后的上清中存在大量直径约17 nm的病毒样颗粒;Western blot和琼脂凝胶免疫扩散试验结果表明该可溶性蛋白可与猪PCV2阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。本研究为制备PCV2d亚单位疫苗和相关检测试剂盒奠定了基础。

猪圆环病毒2d亚型黑龙江株的分离鉴定与遗传进化分析

为了鉴定黑龙江省某猪场疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染死亡的猪只病料,采集疑似PCV2感染的组织并对病毒进行分离培养,通过PCR、免疫荧光、免疫电镜对分离的病毒进行鉴定。对阳性样品进行全基因组扩增,测序后与GenBank上其他不同国家和地区来源的24株PCV的同源性、系统发育树和重组特性进行分析。结果显示,该毒株能够感染PK-15细胞,与藻红蛋白标记的PCV2 Cap蛋白单克隆抗体结合产生特异性荧光,电镜下可见约20 nm的病毒颗粒。分离得到的毒株基因型为PCV2d,命名为LJ0616株,其基因组全长1767 bp,序列上传至GenBank的登录号为ON500676。通过对其核苷酸同源性和重组特性分析,LJ0616株PCV2d与其他21株PCV2毒株的核苷酸序列同源性为55.2%~99.8%,且并未发现重组现象。本研究结果为黑龙江省PCV2的流行病学提供了基础数据,也为该病原的进一步研究奠定了基础。

猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备与鉴定

本研究从临床病料中扩增获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因,并进行序列分析和抗原性比对,然后利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内将Cap基因进行表达,目的蛋白进行Western-blot、IFA、质谱鉴定以及透射电镜和免疫电镜检测。结果表明,扩增获得的PCV2 Cap基因属于PCV2d亚型,在抗原性方面与国内PCV2a、PCV2b代表性毒株及疫苗株存在4个部位的差异;在昆虫细胞内PCV2d Cap蛋白成功表达并具有良好的免疫原性;PCV2d Cap蛋白在昆虫细胞内完成自组装,形成与天然病毒结构相似的病毒样颗粒(VLP)。本研究首次在昆虫细胞内制备出PCV2d亚型病毒样颗粒,为PCV2d亚单位疫苗研制及诊断抗原开发奠定了基础。