黄芩苷对多杀性巴氏杆菌感染猪巨噬细胞后炎症因子表达及信号通路影响的研究

为研究不同浓度黄芩苷对多杀性巴氏杆菌(Pm)HN-13株感染的猪巨噬细胞(HD11)内炎症因子表达的影响及与炎症信号通路的相互作用关系,本研究采用western blot检测HN-13株感染(0、30 min、60 min、90 min)HD11细胞中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路3个关键蛋白(p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK)的表达水平;采用ELISA和荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)分析检测低浓度剂量黄芩苷(L组,20μmol/L)、中浓度剂量黄芩苷(M组,40μmol/L)和高浓度剂量黄芩苷(H组,60μmol/L)对Pm感染的猪巨噬细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平及其m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)和模型组(HN-13);利用抑制剂SCH772984阻断ERK通路,采用ELISA和RT-qPCR检测黄岑苷对Pm感染的HD11细胞内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达及m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)、模型组(HN-13)、抑制组(HN-13+抑制剂)。结果显示:与HN-13株处理0 min组相比,随着感染时间的延长,HN-13株感染HD11细胞中p-ERK/ERK的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01),而p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达量均未发生显著变化(P>0.05),表明,HN-13株可使HD11细胞炎症相关ERK通路蛋白表达增强,且与作用时间呈正相关。与模型组(HN-13)相比,3个浓度剂量的黄芩苷均显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平及m RNA转录水平(P<0.05),且抑制作用随着黄芩苷浓度升高而增强。与抑制组相比,黄芩苷与抑制剂共处理组可以显著抑制HN-13感染的HD11细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及m RNA转录水平(P<0.05)。综上所述,黄芩苷可以抑制Pm感染的HD11细胞中ERK通路相关蛋白的表达和分泌,进而发挥抗炎作用。本研究为研制防治Pm引起的猪肺疫的新药提供了思路。

2017-2020年华东地区猪源多杀性巴氏杆菌耐药性和PFGE分析

为了解华东地区猪源多杀性巴氏杆菌的耐药情况及流行特征,本研究收集了2017—2020年华东地区分离的31株猪源多杀性巴氏杆菌,通过琼脂稀释法检测其对12种临床常用抗菌药物的最小抑菌浓度;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分子分型探求菌株亲缘关系。结果显示:31株猪源多杀性巴氏杆菌,对复方新诺明的耐药率最高(61.29%),其次为泰妙菌素(32.26%)、氟苯尼考(25.81%)、多西环素(12.90%)和大观霉素(3.23%)。所有菌株对头孢噻呋、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星完全敏感;耐药谱型呈现多样化特点,31株猪源多杀性巴氏杆菌共表现为8种耐药谱型,其中有2株3药耐药菌株,耐药谱型分别为DOX+TIA+SPT和FFC+TIA+SXT;依据85%相似性标准可将其分为14个PFGE分型,其中A、G、H、J簇共有19株菌,占61.29%,并且PFGE分型相同的菌株耐药表型也高度相似。研究结果表明,华东地区猪源多杀性巴氏杆菌呈现耐药模式和PFGE分子分型多样化的特性,PFGE分型与耐药表型之间存在一定的相关性,应加强猪源多杀性巴氏杆菌的耐药性监测和流行性防控。

我国中东部主要养猪地区死亡育肥猪呼吸道病原菌的流行病学调查及猪多杀性巴氏杆菌的特性鉴定

【目的】从我国中东部主要养猪地区因呼吸道疾病死亡的育肥猪病料中分离主要病原菌,并进行鉴定和分型,为近年流行的猪呼吸道病原菌的防控治疗提供流行病学依据。此外,对分离的猪多杀性巴氏杆菌(Pm)特性进行鉴定,为Pm疫苗研制提供参考。【方法】收集2021-2023年我国中东部主要养猪地区规模化猪场因呼吸道疾病死亡的育肥猪的病猪肺脏;用血琼脂和TSA培养基分离病原菌,通过微生物学和分子生物学方法鉴定分离菌株;合成adk、est、gdh、mdh、pgi、pmi和zwf基因引物,以分离的Pm为模板进行PCR,通过测序7对管家基因对Pm进行MLST分型;通过PCR对Pm进行荚膜分型和脂多糖分型;通过PCR对Pm的毒力因子进行检测;在ICR小鼠对单一分离的A型和部分D、F型Pm进行毒力鉴定;检测JS-65、JS-51和JS-34在ICR小鼠的LD_(50)。【结果】共分离Pm 73株,分离率为15.53%;分离猪链球菌(SS)71株、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)29株和副猪格拉菌(GPS)10株,分离率分别为15.11%、6.17%和2.13%。分型结果表明,Pm主要为A:L3型,占55%;SS主要为9型,占38.03%;APP主要为15型,占51.72%;GPS主要为5/12型,占60%。混合感染包括Pm+SS,Pm+APP,SS+APP和Pm+APP+GPS,混合感染占总猪群的16.67%。共分离到3种Pm荚膜型:A(67%)、D(30%)和F(3%)型;2种脂多糖型:L3型(56%)和L6型(44%);9种ST分型:ST79、ST50、ST7、ST74、ST13、ST27、ST9、ST287和ST370,所占比例分别为33%、26%、16%、10%、4%、4%、3%、3%和1%。毒力基因检测结果表明:ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、fur、nanH、sodA和sodC的阳性率大于95%;hsf-1、pfhA、tadD、hgbA、hgbB、pmHAS、ompA、ompH、oma87和plpB阳性率在40%-90%之间;tbpA和nanB阳性率在10%-30%;未检出toxA。毒力鉴定结果表明A型菌株在剂量小于10^(2)CFU时导致小鼠全部死亡,D型菌株在10^(3)CFU剂量时小鼠死亡率为60%-100%,F型菌株在5×10^(3)CFU剂量时小鼠死亡率为60%。在ICR小鼠检测JS-65、JS-51和JS-34的LD_(50),结果表明JS-65 LD_(50)<10 CFU,JS-51 LD_(50)=6.3×10^(2)CFU,JS-34 LD_(50)=3.98×10^(3)CFU。【结论】2021-2023年我国中东部主要养猪地区病原菌分离结果表明,Pm、SS、APP和GPS是死亡育肥猪的主要呼吸道病原菌,Pm在肺脏中的分离率最高。采用RIRDC分型鉴定到一株ST370 Pm,拓展了猪Pm的MLST分型数据。Pm优势基因型为A:L3:ST79,其在ICR小鼠中毒力最强,最小致死量小于10 CFU,为后续Pm灭活疫苗研制奠定基础。

猪多杀性巴氏杆菌和猪链球菌混合感染的诊治

猪多杀性巴氏杆菌病是一种急性或散发性传染病,猪链球菌病是一种具有不同临床症状的急性传染病,猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌均是人畜共患病原菌,对不同生长阶段猪群均可造成不同程度的危害,且没有明显品种限制,两者可出现混合感染,引起病猪发生肺炎、脑膜炎及败血症等一系列复杂的严重临床症状。在疾病诊治过程中,常将其作为单一性疾病进行防治,缺乏针对性治疗方案,从而导致两类混合感染疾病周期性流行,严重危害生猪养殖业的经济效益。作为兽医人员,应根据生猪疫病发生流行情况,同时结合病猪的临床症状、剖检变化以及实验室诊断结果进行确诊病情,从而制定针对性防治方案。本文主要结合实际病例,探讨猪多杀性巴氏杆菌和猪链球菌混合感染现象,以期为养殖场对两种疾病混合感染的诊断及防治提供借鉴。

猪多杀性巴氏杆菌病致病机制及诊断技术

近年来,生猪养殖成为乡村经济的重要组成部分,呼吸系统疾病成为阻碍行业健康发展的重要因素之一。多杀性巴氏杆菌病作为猪呼吸系统疾病中一种重要疫病,给养猪业造成巨大经济损失。本文对该病的病原学、致病机制、临床症状、诊断以及防治措施进行了综述,以期为该病的防治提供借鉴。

多杀性巴氏杆菌在猪肺炎中的作用研究

多杀性巴氏杆菌是一种生活在动物口咽间隙的机会致病细菌,人类的感染通常是由猫和狗等宠物的抓伤和咬伤引起的。在特殊条件下,猪感染多杀性巴氏杆菌会导致萎缩性鼻炎,其特征是鼻甲骨萎缩,并伴有鼻部缩短和扭曲。萎缩性鼻炎的病原体是多杀性巴氏杆菌毒素,该毒素由多杀性巴氏杆菌5个血清群中的两个(A和D)产生。

多杀性巴氏杆菌毒力因子Pmorf0222通过TLR1/2激活NF-κB和MAPK信号通路

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)作为巴氏杆菌属最主要的代表菌,能够感染畜禽和野生动物,主要引起禽霍乱、牛出血性败血症、猪萎缩性鼻炎和猪肺疫、以及兔鼻炎等。根据菌体荚膜抗原或脂多糖(LPS)的多样性,可将Pm分为A、B、D、E和F共5种血清群或1~16共16个血清型;最新研究根据LPS外核多糖将Pm分为L1~L8共8个基因型。尽管Pm已经被分离鉴定出来100多年,但对其致病机制及其与宿主的相互作用了解相对较少。

对猪多杀性巴氏杆菌病病例诊治体会

从病原学、发病特点、临床症状、诊断方法及防治措施等方面,对猪多杀性巴氏杆菌病做了全面论述。并举例湖南省洞口县猪多杀性巴氏杆菌腹式呼吸型病例诊治情况,用“链霉素+青霉素”肌肉注射治疗,治疗病猪212头,治愈201头,治愈率94.8%。用中药黄芩、栀子、当归、川穹、牛姜子等中药处方治疗猪萎缩性鼻炎39头,治愈37头,治愈率94.9%。总结治疗猪多杀性巴氏杆菌病的体会,供养猪业同行参考。

猪多杀性巴氏杆菌(PM)PCR诊断技术的建立

参照文献报道的猪多杀性巴氏杆菌(PM)基因组的部分序列,设计合成引物,建立了PM的PCR诊断技术,并对各反应条件进行优化。本实验建立的PM的PCR扩增片段大小为457 bp。以建立的PCR方法对临床送检的可疑病猪的肺部病料进行了特异性检测和敏感性试验及生化鉴定。结果表明PCR检测阳性结果与猪多杀性巴氏杆菌的形态染色、培养特性和生化鉴定结果一致,该PCR方法在临床诊断中具有应用价值。

猪繁殖与呼吸综合征病毒与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊断

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)因病猪耳部皮肤呈蓝紫色而被业内人员称为“猪蓝耳病”,该病以怀孕母猪早产、流产,或产出死胎、畸形胎、弱胎和仔猪呼吸困难为主要临床特征。PRRS的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),目前我国猪病临床上已发现的PRRSV包括美洲型毒株(经典毒株、高致病性毒株、类NADC30毒株、类NADC34毒株)和欧洲型毒株;美洲型毒检出明显多于欧洲型毒株。

猪多杀性巴氏杆菌OmpW、TbpA蛋白的原核表达及免疫原性研究

【目的】研究猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白的免疫原性,探索其作为疫苗候选抗原的可能。【方法】对NCBI中不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中OmpW和TbpA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并对OmpW和TbpA蛋白进行生物信息学分析。基于此,构建重组表达菌株pET28a-OmpW-BL21和pET28a-TbpA-BL21,重组OmpW和TbpA蛋白经镍柱亲和层析纯化后与氢氧化铝佐剂混匀制备亚单位疫苗,免疫小鼠后使用猪多杀性巴氏杆菌GX-PmD4菌株攻毒,评估OmpW和TbpA蛋白的免疫原性。【结果】相似性比对发现,OmpW和TbpA蛋白在不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中高度保守;SignalP 6.0 Server和TMHMM Server v.2.0软件预测发现OmpW蛋白有信号肽和跨膜区,而TbpA蛋白有信号肽无跨膜区;ABCpred软件分析显示,OmpW和TbpA蛋白分别有14和22个B细胞抗原表位;SOPMA和SWISS-MODEL软件进一步预测蛋白结构表明:OmpW和TbpA蛋白的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占16.18%、5.39%、36.76%、41.67%和40.42%、5.69%、16.77%、37.13%。经原核表达获得的重组OmpW和TbpA蛋白均具有较强的抗原性。在免疫小鼠后的14和28 d,与对照组相比,血清中OmpW、TbpA特异性抗体水平极显著上升(P<0.01)。小鼠免疫攻毒试验结果显示,重组OmpW组和TbpA组的小鼠存活率分别为50.0%和37.5%。【结论】本研究成功表达了猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白,且重组OmpW蛋白免疫原性较强,可作为猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效候选抗原。

猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗制备及免疫效果评估

【目的】制备猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,有效控制巴氏杆菌病的发生和流行。【方法】从发病猪病料中分离猪源A型多杀性巴氏杆菌,测定生长曲线,通过小鼠致病性试验筛选疫苗候选菌株。将筛选得到的疫苗候选菌株培养后进行灭活,无菌检验合格后,按1∶4的比例与SUMMIT-CB-200佐剂混合,制备猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗。最后通过小鼠和仔猪免疫攻毒保护试验评估疫苗保护力。【结果】分离到11株猪源A型多杀性巴氏杆菌;生长曲线测定结果显示,11株菌均在培养至6 h时达到生长稳定期,活菌数范围为2.1×10^(9)~8.4×10^(9)CFU/mL;小鼠致病性试验结果显示,攻毒后小鼠出现精神沉郁、食欲降低、行动迟缓、被毛粗糙、扎堆、眼睛周围大量脓性分泌物、腹式呼吸、共济失调等症状,共筛选到A4、A8、A9和A11 4株疫苗候选菌株,其中最强毒株A4小鼠皮下攻毒半数致死量(LD50)为167 CFU;仔猪毒力试验结果显示,攻毒后仔猪出现精神沉郁、食欲降低、皮肤发红、呕吐、呼吸困难、腹式呼吸、体温升高、关节肿大、跛行等症状,A4菌株仔猪皮下攻毒LD50为1.72×10^(10)CFU;免疫攻毒保护试验结果显示,4株猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对小鼠和仔猪均具有一定保护力,其中A9保护力最强,对小鼠保护率达60%,对仔猪保护率达75%。【结论】本研究制备的灭活疫苗能对猪源A型多杀性巴氏杆菌强毒株提供较好的免疫保护力,具有一定的开发价值。

东北地区猪巴氏杆菌病的诊断与治疗

猪巴氏杆菌病也称出血性败血症、猪肺疫,是一种多由多杀性巴氏杆菌引发的传染病。主要临床症状有:消瘦、出血性败血症,常伴随呼吸道、消化道炎症。近年来该病在东北地区发病率相对较高,一般在夏末秋初等气温骤变季节多发。育肥猪和母猪发病较多。

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66 株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)。然后做了药敏试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致;PCR分型表明有46株为D型Pm,18株为A型Pm,1株为B型Pm,1株无法定型;有8株用PCR检测为T+ Pm;豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8 株T+ Pm都为D型,都分离于有严重PAR症状的猪。

猪巴氏杆菌病的诊断与防控措施

猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染所诱发的疾病类型,该疾病的传染性强,呈现散发性特征,一旦在养殖过程中出现,会对养殖工作发展造成极大威胁。该疾病又称作猪肺疫、锁喉风,对猪呼吸系统造成的威胁极大,且疾病高发与饲养管理之间存在密切联系。因此,加强饲养管理、科学防控有助于疾病控制,促进养殖业健康发展。

猪源多杀性巴氏杆菌的生物学鉴定与荚膜PCR分型

从表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离出13株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),采用Pm种特异性的KMT1-KMT2引物进行PCR扩增,结果与传统的生化反应鉴定完全一致。基于对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,Q_1、Q_3、Q_6、Q_7、Q_(10)、Q_(13)和C_(48-1)鉴定为Pm多杀亚种(Pm subsp.multocida);Q_2、Q_4、Q_5、Q_8、Q_9、Q_(11)、Q_(12)鉴定为Pm败血亚种(Pm subsp.septica)。对13株Pm分离物采用A型、B型和D型引物进行PCR扩增,8株鉴定为A血清型(61.5%);5株鉴定为D血清型(38.5%);没有发现B血清型的菌株。同时对金黄色葡萄球菌抑制试验、中性吖啶黄沉淀试验与荚膜PCR分型的相关性进行了讨论。

猪源A型和D型多杀性巴氏杆菌强毒菌株的生物学特性比较研究

为分析猪源A型和D型多杀性巴氏杆菌(PM)的生物学特性差异,本研究对5株A型和5株D型猪源PM强毒菌株的生化特征、生长特性、毒力特性、16SrRNA基因分子特征等生物学特性进行了比较研究。在TSB液体培养基中的生长曲线测定结果表明这些菌株均能够高密度发酵培养;21种生化试验的反应结果表明,10株PM的生化反应均不一致,即使同一血清型的不同菌株之间也具有较大差别。对小鼠毒力试验结果表明,A型PM菌株的毒力(LD_(50)为4 cfu^26 cfu)显著强于D型菌株(LD50为2.1×10~4 cfu^5.2×10~5 cfu)。16SrRNA基因的序列分析结果表明,16SrRNA基因非常保守,这10株PM之间的同源性均在99.8%以上;在1 505 bp序列中,仅存在第57 bp(T/C)、239 bp(T/C)和376 bp(G/C)处3个多态性位点,并且不具有型特异性。本研究为猪源PM灭活疫苗菌株的筛选等提供了实验依据。

我国猪群中多杀性巴氏杆菌的基因型分析

本研究旨在了解我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌(Pm)的主要基因型。利用荚膜基因分型、脂多糖(LPS)基因分型、多位点序列分型(MLST)对2013年12月—2017年12月4年间来源于我国各地区规模化猪场患有疑似呼吸系统疾病的病死猪肺、鼻拭子、气管、肝等样品中分离鉴定的Pm进行基因型分析,并对23种主要毒力基因进行检测。结果表明,当前在我国猪群中流行的Pm的荚膜基因型为A(48.85%)、D(42.75%)、F(2.67%),优势基因型为A和D;LPS基因型为L3(25.00%)和L6(75.00%)型,优势基因型为L6;MLST基因型为ST3(21.25%)、ST10(27.50%)、ST11(42.50%)、ST12(2.50%)、ST16(2.50%)、ST74(1.25%)及ST75(2.50%),优势基因型为ST3、ST10和ST11。如果将荚膜基因型、LPS基因型和MLST基因型组合起来看,当前在我国猪群中流行的Pm的主要基因型为荚膜:脂多糖:MLST基因型A:L3:ST3(20.00%)、A:L6:ST10(26.25%)及D:L6:ST11(42.50%)。毒力基因检测的结果发现部分毒力基因的分布表现出一定的"基因型偏好性"。结果提示,D:L6:ST11是我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的主要基因型,可能与我国猪群中由多杀性巴氏杆菌导致的呼吸道疾病密切相关。

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

为了解各血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)在四川、重庆、云南的流行情况,对2013—2014年间四川、重庆、云南等地8个规模化养殖场的125份病死猪肺炎样品进行细菌分离,并用PCR方法对分离的多杀性巴氏杆菌进行鉴定及荚膜血清分型。结果表明:从有肺炎症状病死猪的肺脏样品中共分离出11株多杀性巴氏杆菌,其中有7株为A血清型(63.6%),3株为D血清型(27.3%),1株为F血清型(9.1%),没有发现B和E血清型。表明在该区域内,猪肺疫主要是由A型Pm感染引起。另外,此次还分离出了1株较少见的F型多杀性巴氏杆菌。该结果可为上述地区巴氏杆菌病的防治提供科学材料。

猪的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的优化,成功地建立了APP、PM、HPS的复合PCR实验室诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增出APP的342bp、PM的457 bp 和HPS 的821 bp 的特异性片段。该复合PCR 能同时检测到100 个每种细菌或50 pg 的APP 或HPS 的DNA和500 pg的PM的DNA。该三重复合PCR的敏感性同已报道的单PCR 一致。该方法的建立对临床上进行这3 种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。