猪心肌高铁肌红蛋白还原酶米氏方程建立与动力学研究

以马心肌高铁肌红蛋白为参照,研究猪心肌提取液中高铁肌红蛋白还原酶(MetMbase)在猪心肌高铁肌红蛋白(MetMb)存在条件下酶活性的表达,MetMbase米氏方程建立和动力学特征。结果证实:影响MetMbase活性表达的主要因素有pH值、反应时间和温度等。当反应体系中底物浓度与酶液体积一定时,MetMbase最佳反应条件为pH6.4(P<0.01)、温度35℃(P<0.05)和时间30min(P<0.05)。猪心肌MetMb为底物时,MetMbase米氏方程为:Y猪=0.0004X+0.0083(R2=0.9948),Km为4.82×10-5mol/L,Vmax为120.48nmol/min·g。体外条件下,当pH<6.0或pH>7.0时,MetMbase的活性逐渐降低;低温时酶活性表达明显受抑制;随温度升高到20℃后,该酶活性高表达;但温度超过50℃时,酶失活。本实验结果提示,生鲜肉处于冷链条件(4～10℃)下,有利于酶活性的稳定,从而益于维系理想的肉品色泽和肉品品质。

仔猪心肌原代细胞培养及其对口蹄疫病毒敏感性研究

目的旨在建立仔猪原代心肌细胞的培养方法,探索O型口蹄疫病毒对易感动物心肌原代细胞的敏感性,为研究O型口蹄疫感染引发幼畜心肌炎致病机理提供细胞模型。方法利用混合消化酶(2g/L胰蛋白酶(trypsin)和1g/LⅡ型胶原酶(collagenase)1∶1混合)消化法培养原代心肌细胞;相差显微镜观察心肌细胞生长和波动情况;胎盘蓝对细胞染色,鉴定细胞成活率。将生长良好的原代心肌细胞接种口蹄疫O型乳鼠毒观察其敏感性,同时将该毒接种BHK21细胞做平行对比。结果仔猪原代细胞成活率为95.6%;成活细胞形态完整,部分细胞自行蠕动,当生长成片后可见呈岛屿状搏动。仔猪原代心肌细胞对O型口蹄疫病毒敏感。与BHK21细胞相比,结果无明显差异。结论本试验成功培养了仔猪心肌原代细胞,并且培养的原代细胞对O型口蹄疫病毒敏感。

用染料修饰吐温80液-固萃取体系从猪心肌匀浆液中分离纯化心肌黄酶

用三嗪类染料 Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ－Ａ修饰的吐温８０，与吐温８０、硫酸被构成液－固萃取体系，从猪心肌匀浆液中分离纯化心肌黄酶。研究了吐温８０染料修饰物在吐温８０相中所占的比例、分相盐浓度、溶液的酸度、匀浆液的加入量等对匀浆液中酶及杂蛋白在两相中分配的影响。在室温条件下，酶选择性地进入吐温８０固相，杂蛋白主要留在盐水相。匀浆液中心肌黄酶的酶活力平均收得率为８１．４％，一步纯化倍数为６．６。降低盐浓度，提高盐水相酸度，能使酶从吐温８０固相反萃到盐水相。

猪心肌高铁肌红蛋白荧光光谱测定条件的确定及功能域的指认

以纯猪心肌高铁肌红蛋白(p Met Mb)为对象,建立荧光光谱条件并经同步荧光指认其主要功能域.研究表明,以600 nm/min扫描速度和中等响应时间为基本条件,p Met Mb的适宜荧光光谱条件分别是20 mmol/L p Met Mb、10 nm狭缝宽度和270 nm或430 nm为激发光波长.经同步荧光光谱解析,酪氨酸(Tyr-)、色氨酸(Trp-)和铁卟啉环(heme-Fe3+)荧光特征峰分别在312、355和630 nm处.270 nm是Trp-和Tyr-适宜激发光波长,而430 nm是heme-Fe3+适宜激发光波长.与马肌红蛋白(h Mb)比较,其Trp-和heme-Fe3+荧光光谱特征峰出现红移.430 nm可激发630 nm处heme-Fe3+,发生电子迁移和能量跃迁.随着Trp-和heme-Fe3+特征峰的红移,推测p Met Mb中heme-Fe由五配位高自旋(Fe2+)转变为六配位低自旋(Fe3+).

猪心肌高铁肌红蛋白高级结构动态信息的光谱指认

本实验采用扫描电子显微镜、X射线衍射、拉曼、红外等现代光谱技术和数据库、计算软件等,层层剖析猪心肌高铁肌红蛋白(pig metmyoglobin,p Met Mb)冻干粉的结构特征和分子动态结构信息。结果表明,p Met Mb冻干粉表观呈明显的棱状结晶体,结晶度为(95.60±1.37)%,三晶胞轴长不相等(a≠b≠c),可归属于高晶度含水单斜结晶体。根据晶体数据库同类化合物比对,得到p Met Mb肽链和heme-Fe的关键基团来源;经拉曼和红外光谱解析和推算,p Met Mb肽链均有α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲4种蛋白质二级结构,分别占50%、14%、24%和12%;分别由3个酰胺区中C=O、C=C、C—N、—COO-、C—H、N—H的不同振动形式所产生;六配位低自旋的Fe—C—N形成heme-Fe3+。因此,p Met Mb为六配位低自旋构象,是结构紧密、性质稳定的球状蛋白质。

猪心肌高铁肌红蛋白分子结构解析

本研究分别运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectropHoresis,SDS-PAGe）、紫外光谱、氨基酸分析、质谱和分子信息技术,比较中国山猪心肌高铁肌红蛋白（pig metmyoglobin,pMetMb）分子信息和三维结构。结果表明：pMetMb肽链至少含有133种氨基酸组分,但较hMb缺少脯氨酸（Pro）和精氨酸（Arg）;与美国国家生物技术信息中心（national Center for Biotechnology Information,nCBI）数据库猪野生型gi｜494385比对,其匹配度79.7%（置信度100%）,故推测肽链长度在133~153之间。pMetMb含有7个α螺旋和2个310螺旋,由于310螺旋存在（马Mb没有）,使肽链中疏水基团作用加强,形成更加紧密盘叠的球状亚基;第6和7螺旋的His64和His93的咪唑基团N（Im n—）与Fe2＋/Fe3＋键合,构成核心heme-Fe功能域;它镶嵌于蛋白质内部疏水结构内,更便于电子传递和Fe2＋/Fe 3＋氧化还原反应,维系肉色。

猪心肌炎病发病特点及防治

猪心肌炎病又被称为猪脑心肌炎病,是由病毒感染引发的一种广泛传播的病毒性传染性疾病,该种疾病的致病原为脑心肌炎病毒,典型的临床特征是脑组织发炎和心肌出现炎症。猪感染病毒后,还会不断向外传播病毒,危害某些哺乳类动物。随着生猪规模养殖产业不断扩大,猪心肌炎病的发生几率呈现逐年上升的态势,如果没有做好有效的防范工作,会向周边牲畜传播蔓延,带来的危害严重。该文主要论述猪心肌炎病的流行特点、临床表现、病理特征和防治措施。

猪心肌炎的流行病特点与防治

近年来,我国畜牧养殖结构调整,生猪养殖规模扩大,传染病也随之增多。猪心肌炎是近年来较为多发的病毒性传染病。该病对仔猪危害最为严重,主要特征为脑炎、心肌炎、心肌周围出现炎症病变。在实际工作中,需要对养殖场进行全面排查,筛查出潜在的感染源。同时,应加强养殖场的环境卫生管理,必须严格执行消毒防疫措施。此外,我们还可以通过疫苗预防和合理饲养管理来降低疾病的发生率。

猪脑心肌炎病毒病的诊断与综合防治

猪脑心肌炎是一种由脑心肌炎病毒引起的猪类传染病,该病可以感染不同年龄的猪,在不同的养殖场与不同养殖模式下,发病概率与致死率也存在差异性,仔猪感染后危害严重。临床主要特征为心肌炎、脑炎。该病毒的宿主为灵长类动物、野生动物与啮齿类动物。该病死亡率较低,但对仔猪的生长发育影响较大,造成猪群养殖周期延长,若不及时采取防控措施,易造成继发感染,对该病的诊断与防治工作增加难度。因此,饲养管理人员应全面掌握该病的流行动态,采取有针对性的防控措施。

猪心肌高铁肌红蛋白分子动力学结构功能域的荧光光谱指认

95%纯度的猪心肌高铁肌红蛋白(pMetMb)由本实验室制备(国家发明专利No.CN200610037909.X),用于研究它的分子动力学结构和功能域(荧光光谱)。为了控制试验质量和保证结果的可靠性,采用4因素×5水平的单因素方差试验来选择适宜的试验条件,包括pMetMb浓度、荧光仪狭缝宽度、激发光波长和同步荧光波长差(Δλ)等。试验条件在2×10-4

猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定

从规模化猪场疑似病例组织病料中分离到5株脑心肌炎病毒（EMCV），对其中的2株（EMCV BJC3和EMCV HB1）进行了系统鉴定。结果表明，病毒粒子大小约为27nm，呈圆形；2株病毒均不耐酸，对氯仿不敏感，对胰蛋白酶敏感性有所不同，60℃加热1h可被灭活，二价阳离子对病毒没有明显的保护作用。用EMCV多克隆抗体作间接免疫荧光，分离毒株感染的BHK-21细胞的胞浆中可见特异性荧光。对分离毒株进行了VP1和3D基因的扩增和序列测定，结果表明，2个毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为99．49％，氨基酸序列的同源性为98．46％，与GenBank中EMCV毒株的核苷酸序列同源性介于81．61％～99．59％，氨基酸序列同源性在95．5％以上；3D基因扩增片段序列与其它毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100％。基于VP1基因的系统进化树表明，2株分离毒均位于进化树的主干上，变异度不大。由此表明，EMCV感染已在我国猪场存在。

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。

猪脑心肌炎疫苗研究进展

近年来,猪脑心肌炎在一些国家和地区暴发,不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,而且还威胁到人类的生命健康,以疫苗免疫为主要手段的防控措施日渐得到广泛关注。高效安全的猪脑心肌炎新型疫苗一直是科研人员关注的焦点,大量的新型疫苗由此而生。目前,亚单位疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗以及载体疫苗被公众认为是可以考虑作为替代传统疫苗的新型疫苗,论文介绍了当前猪脑心肌炎疫苗的应用现状和新型疫苗的开发研究进展。

猪心肌高铁肌红蛋白还原酶高级结构及功能域的荧光表征

猪高铁肌红蛋白还原酶(pMetMbase A)是肌红蛋白氧化还原系统中被新认识的还原酶,它的分子结构有待荧光光谱表征。本研究采用普通及同步荧光法,以求证该酶特征荧光发射光谱和结构功能域。pMetMbase A的优化荧光光谱条件是,扫描速度600nm/min、光栅狭缝10nm、溶液浓度1.0×10-2mmol/L、激发光波长270nm和波长差20nm。结果表明,pMetMbase A具有自己的特征荧光发光谱带;311和349.5nm处分别是酪氨酸和色氨酸残基的特征荧光;650nm处是其卟啉环-铁(heme-Fe)双硫键的特征荧光,推测为电子传递和还原反应的核心活性位点。因此,该pMetMbase A具备蛋白质的肽链和heme-Fe结构。

猪细小病毒和猪源脑心肌炎病毒的二重PCR检测方法的建立

试验旨在建立能同时检测猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和猪源脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EM-CV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中PPV VP2基因和EMCV 3D基因序列,利用Premier 5.0软件设计出PPV和EMCV的特异性引物。通过优化反应条件,建立了能同时特异性检测PPV和EMCV的二重PCR方法,PPV和EMCV的敏感性检测极限分别达7.62和1.22×10-1pg/μL。通过对临床36份样品的检测结果表明,该二重PCR检测方法敏感、特异,适合于临床检测应用。

猪源脑心肌炎病毒GXLC株对小鼠的致病性试验

为研究猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株对小鼠的致病性,将其接种4周龄健康BALB/c小鼠,观察临床症状,检查病理变化,测定心重/体重比值,检测心脏、脑、脾脏组织及血清中病毒含量,检测心脏、脑、脾脏组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平及血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量。结果显示,感染小鼠出现明显的临床症状,感染后第4天开始死亡,第5～7天死亡达到高峰;心脏、脑出现典型的大体病理变化和组织病理学变化,心重/体重比值显著升高、组织病理学炎症分值显著增加;感染后第1天即可在心脏、脑、脾脏及血清中检测到大量病毒,直至第14天仍能检测到病毒;血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量显著升高,心脏、脑、脾脏组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著上调,而且细胞因子表达的高峰期与出现明显临床症状、严重病理损害及死亡高峰期密切相关。结果表明,猪源EMCV GXLC株对小鼠具有高度致病性,IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子在EMCV对小鼠的致病机制中发挥重要作用。

TaqMan实时荧光RT-PCR检测猪脑心肌炎病毒方法的建立与应用

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)基因组保守区域,设计并合成了特异性引物和TaqMan探针,建立了EMCV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。通过常规RT-PCR方法扩增EMCV保守序列并将其连入pMD19-T载体,制备阳性标准质粒,优化反应条件,以10倍梯度稀释的标准品绘制标准曲线,EMCV标准曲线的相关系数为0.999。结果显示,该方法检测灵敏度达到10拷贝/μL,对猪捷申病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒检测结果均为阴性。方法重复性好,批内和批间变异系数均小于2%。检测采集自上海供港猪场、进境美国种猪、加拿大、法国种猪的血清样本145份,EMCV核酸的检出率国内猪场53.6%,美国猪检出率为27.6%,加拿大猪检出率为20%,法国猪检出率为26.7%。EMCV实时荧光RT-PCR方法的建立为该病的快速诊断和流行病学调查提供了有效手段。

我国不同地区猪脑心肌炎和细小病毒流行病学调查

猪脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）属于小RNA病毒科、心病毒属成员,能引起猪以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病[1-3]。EMCV感染的妊娠母猪则以流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍为主要特征,其他猪多呈隐性感染状态[4-6]。目前,多个国家和地区不时的报道了该病发生和流行[6-8]。猪细小病毒（Porcineparvovirus PPV）是引起猪繁殖障碍的一个非常重要的病原体之一。

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。

猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定

猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(EMCV)引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。本试验从河北地区的发病猪场的疑似病料中,分离到1株致BHK-21细胞病变的病毒,命名为BD2,用RT-PCR扩增EMCV的3D基因,进行琼脂糖凝胶电泳,结果出现清晰的条带。初步鉴定该分离株为猪脑心肌炎病毒。