猪急性腹泻综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种鉴定猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)的RT-PCR方法,根据NCBI登录的SADS-CoV N基因保守区域序列,设计了3对引物(P1、P2和P3),通过对SADS-CoV及其他6种病毒进行检测,筛选出最合适的引物,然后对退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、rTaq DNA聚合酶浓度和循环次数等反应条件进行了优化。结果显示,P3引物对SADS-CoV特异性最好,与其他病毒无交叉反应。敏感性试验显示,该方法最低检测限可达9.55×10~2 copies/μL;重复性试验显示该方法重复性良好。运用建立的RT-PCR方法,对广东省的21份临床样品进行检测,结果检出SADS-CoV阳性样品4份,阳性样品的测序结果与其RT-PCR完全一致。结果表明,本研究成功建立了一种鉴定SADS-CoV的RT-PCR方法,且该方法具有检测快速、成本廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可以用于SADS-CoV的临床诊断。

猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒的流行、致病机制及防控研究进展

目前发现的猪肠道冠状病毒主要有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪三角冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)4种。其中SADS-CoV是2017年首次在我国广东省发现的一种猪肠道冠状病毒,该病毒感染后可致小于5日龄仔猪出现严重急性腹泻、急性呕吐、脱水等症状,死亡率较高,给养猪业造成巨大的经济损失。目前还未见针对SADS-CoV的有效药物和疫苗产品上市,从病毒传播、致病机制、诊断及预防控制等方面综述SADS-CoV的研究进展,期望为SADS-CoV的防控提供参考。

猪急性腹泻综合征冠状病毒检测方法研究进展

猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是一种来源于菊头蝠的新型猪冠状病毒,2017年初首次发现于我国广东省腹泻仔猪,并已在广东省出现两次大流行,不仅给养猪业带来了挑战,同时也带来了潜在的公共卫生安全问题。鉴于目前尚无有效的药物和疫苗,为实施高效监测以控制SADS-CoV流行,便于相关部门选择适宜的检测方法,就病毒分离鉴定、RT-PCR、巢式RT-PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、微滴式数字PCR(ddPCR)、逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)、基因组测序技术(NGS)、免疫荧光测定(IFA)、萤光素酶免疫沉淀系统(LIPS)、免疫组织化学(IHC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等SADS-CoV检测方法的研究进展予以综述。分析认为:各种检测方法都有其自身的优缺点以及适用场景,单一方法往往不能满足目前临床检测的需求,需要将不同的检测方法结合使用,通过优势互补,来实现对病毒的快速精确检测,并使检测方法更加简单、高效和低成本;实现病毒检测简化操作、快速和同时检测多种病毒的方法,将成为今后主要研究方向。随着检测技术的不断完善和创新,相信将会有更多的新型检测方法用于SADS-CoV检测。

猪急性腹泻综合征冠状病毒病原学及防治研究现状

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是2017年首次在中国广东发现的一种新型猪肠道冠状病毒,可引发新生仔猪剧烈呕吐、腹泻、严重脱水甚至死亡。除了对养猪业造成直接威胁外,SADS-CoV还具有潜在的广泛种属嗜性,可能对公共卫生造成威胁。文章对该病毒的分子病原学、检测方法和防治策略进行综述,以期为后续SADS-CoV的科学研究和有效防治提供参考借鉴。

猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其抗体序列的分析

猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)目前尚未有商品化诊断试剂盒,为填补行业空白,本研究制备了抗SADS-CoV核衣壳(N)蛋白单克隆抗体并对其序列进行了分析。利用原核表达系统表达SADS-CoV N蛋白并进行纯化,纯化的N蛋白作为免疫源免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得5株能够稳定分泌抗SADS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞株,将其命名为1C10、4B10、6G1、6F3和6E8;此外,利用套式PCR扩增技术获得了抗体可变区基因序列。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,5株单抗特异性识别Huh7细胞感染的SADS-CoV。ELISA结果表明,5株单抗与纯化的SADS-CoV N蛋白具有良好的反应性,但是,与SADS-CoV反应性分析发现,只有6E8的反应性较好,其余四株均不反应。Western blot结果表明,5株单抗均能特异性识别纯化的以及SADS-CoV感染表达的N蛋白。亚类分型鉴定结果表明,1C10、4B10、6G1和6F3重链为IgG1型,6E8为IgG2a型,它们的轻链为Kappa型。截短表达分析表明,5株单抗识别N蛋白的区域为1-142 aa。总之,本研究制备的抗SADS-CoV N蛋白单克隆抗体为SADS-CoV新型诊断方法的开发以及SADS-CoV N蛋白功能及结构的研究提供了有用的工具。

猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬机制解析

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-Co V)是2017年在广东省新发现的猪肠道冠状病毒,引起新生仔猪呕吐、腹泻、脱水以及死亡。迄今为止,该病毒已经先后在广东、福建、江西和广西这4个省份的个别猪场检测到,有可能威胁我国的生猪养殖产业及潜在感染人类。目前,SADS-Co V诱导或抑制细胞自噬的信号途径及调控病毒复制机制仍不清楚。尽管细胞自噬在病毒感染过程中发挥的作用已有大量研究,但其在SADS-Co V感染中的作用还不明确,特别是其作用的分子机制仍然不清楚。因此,了解SADS-Co V诱导细胞自噬的机制有助于研究病毒与侵染细胞之间相互作用的关系,同时为防控SADS-Co V感染奠定理论基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10^(1)~3.31×10^(7)拷贝·μL^(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10^(1)拷贝·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^(6.7)、10^(5.3)拷贝·mL^(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。

猪急性腹泻综合征冠状病毒RT-LAMP快速检测方法的建立与应用

为建立简捷、灵敏的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)检测方法,本研究针对SADS-CoV N基因片段保守区域设计特异性的反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,经条件优化后显示建立的SADS-CoV RTLAMP检测方法最佳反应条件为64℃,50 min,初步建立SADS-CoV的RT-LAMP快速检测方法。利用该方法检测SADS-CoV、猪流行性腹泻性病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪肠道病毒9型(PEV9),评估其特异性,结果显示除SADS-CoV外,该方法与其它病原无交叉反应,特异性较强;将病毒RNA 10倍倍比稀释后作为模板,利用该RT-LAMP与普通RT-PCR同时检测,结果显示,RTLAMP方法比普通RT-PCR方法的敏感性高103倍,敏感性较高。以同一批次或不同批次的SADS-CoV核酸为模板进行RT-LAMP试验,结果显示RT-LAMP批内批间均可稳定的检出阳性样本,表明该方法具有良好的重复性和稳定性。对经口服感染SADS-CoV和未感染仔猪的临床样本进行检测,结果显示RT-LAMP与普通RT-PCR检测结果高度一致。本实验首次建立的SADS-CoV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高,操作简便、快速和高通量检测的优点,为临床SADS-CoV感染的快速诊断和综合防控提供检测手段。

猪急性腹泻综合征病毒N基因多克隆抗体的制备及其生物信息学分析

目的制备SADS-CoV N蛋白的多克隆抗体,进一步了解及探究SADS-CoV N蛋白的基本结构,为猪急性腹泻综合征病毒疫苗的研制奠定基础。方法将N蛋白基因片段克隆至pColdⅡ载体,并将其转化至BL21感受态细胞,采用1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,经Ni-NTA柱纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用生物信息学软件对SADS-CoV N蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、三级结构及B淋巴细胞与T淋巴细胞抗原表位进行预测。结果重组菌在37℃经1mmol/L IPTG诱导表达分子质量为48 ku的目的蛋白,与预期N蛋白分子质量相符。用该蛋白免疫小鼠,制备的抗N蛋白多克隆抗体的效价可达1︰200000;经IFA、Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能够特异性识别SADS-CoV感染猴肾细胞(Vero)表达的N蛋白,具有较高的抗体效价及特异性。生物信息学分析SADS-CoV N由375个氨基酸组成,分子质量为41.636 ku,等电点为9.90;N蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构;螺旋和无规则卷曲是N蛋白二级结构中主要的蛋白质元件;N蛋白存在9个潜在的B细胞表位,第127-135位、134-142位、275-283位可能存在T细胞表位。结论成功构建pColdⅡ-SADS-CoV-N重组质粒,用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得高效的特异抗体血清。生物信息学预测SADS-CoV N含有丰富的螺旋和无规则卷曲结构,以及B、T淋巴细胞抗原表位,为揭示SADS-CoV N蛋白的功能及SADS-CoV相关的转录机制奠定了基础。

猪病毒性腹泻有效防控——生猪产业无法回避的现实问题

猪病毒性腹泻并不是一种传染病,而是一大类感染消化道病毒病的统称,因其临床症状均导致腹泻而得来,其病源包括4种猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒(PoRV)。猪肠道冠状病毒主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和新发的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)。

猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)的多重荧光定量RT-PCR方法,本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针,经各反应条件优化后,建立了检测PEDV、PDCoV、SADS-CoV的多重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法仅对PEDV、PDCoV、SADS-CoV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等的核酸检测均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组质粒标准品的检测下限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,且在10^(1)拷贝/μL~10^(6)拷贝/μL范围内各重组质粒均与各自的Ct值有良好的线性关系。重复性试验结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均在0.33%~2.53%,重复性和稳定性均较好。利用建立的多重荧光定量RT-PCR方法对采自河南各地的100份临床样品进行检测,并与3种病毒的单一RT-PCR检测方法、相应病毒的标准检测方法(由于SADS-CoV无标准检测方法,则采用RT-PCR扩增后测序并经NCBI BLAST比较分析测序结果)进行比较分析,以评估本实验建立检测方法的临床应用效果。多重荧光定量RT-PCR结果显示,PEDV、PDCoV、SADS-CoV的阳性率分别为38%(38/100)、14%(14/100)、5%(5/100),不存在混合感染现象,与PEDV、PDCoV标准检测方法的符合率为100%,且敏感性高于单一RT-PCR方法。本研究首次建立了一种特异、敏感、快速的多重荧光定量RT-PCR方法,可以用于PEDV、PDCoV、SADS-CoV的鉴别检测,为猪腹泻类疫病鉴别诊断及防控奠定基础。

猪急性腹泻综合征冠状病毒致病机理的研究进展

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)又名猪肠道α冠状病毒(Porcine enteric alphacoronavirus,PEAV)/猪肠道甲型冠状病毒(Swine enteric alphacoronavirus,SeACoV),属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科α冠状病毒属成员,是2017年初在中国广东省新发现的一种新型致病性肠道冠状病毒^([1-3])。

基于免疫信息学方法设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒S、M及E蛋白的多表位疫苗

【目的】设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)S、M及E蛋白的多表位疫苗。【方法】本研究选用IEDB预测SADS-CoV S、M及E蛋白T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类分子结合表位;用NetMHCIIpan 4.0 Serve预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位;用Immunomedicine Group、IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出重叠表位区域作为优势表位,运用IEDB、AllerTOP v 2.0 Servers筛选出高保守性、非致敏性的优势表位区域,通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力,最后进行基因克隆。【结果】经筛选后的高保守性、非致敏性优势表位构建的多表位疫苗相对分子质量为35.30 ku,为稳定亲水蛋白,具有良好的抗原性,存在1个N-糖基化位点,在二级结构中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和β-转角分别占22.11%、20.35%、50.88%和6.67%。三级结构Ramachandran作图显示优势区域中含有残基数占到90.00%,进行细化后优势区域的残基数增加到91.92%,三级结构突出表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性,分子对接表明多表位疫苗与TLR3具有高亲和力。经密码子优化、反向翻译和基因克隆确保设计的多表位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中高效、稳定的表达。【结论】构建的多表位疫苗抗原可有效表达并可能诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为SADS-CoV多表位疫苗的设计提供了一种新的方法,为SADS-CoV多表位疫苗的研发提供了理论依据及数据支持。

猪急性腹泻综合征冠状病毒调控细胞凋亡机制解析

冠状病毒(Coronavirus,Co Vs)是自然界中广泛存在的一大类病毒,人类以及常见的哺乳类动物和禽类等都易感。主要感染上呼吸道和胃肠道,多发于冬春季节,呼吸道感染引起发热、呼吸道炎症等感冒症状;消化道感染导致呕吐、腹泻、脱水消瘦等症状。

华南猪群猪急性腹泻综合征的诊断和病原鉴定

2017年11月,华南某猪场新生仔猪出现急性呕吐和严重水样腹泻、体重迅速减轻和急性死亡,病死率90%～100%。经实验室PCR诊断,排除猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等常见腹泻传染病后,诊断为猪急性腹泻综合征(Swine acute Diarrhoea Syndrome, SADS),由一种新型的蝙蝠冠状病毒(SADS-CoV)引起。针对其编码的N基因设计一对特异性引物扩增该片段并测序,使用DNA Star和MEGA 7.0软件进行同源性分析。结果:成功克隆了该病毒的N段基因,序列长度为1 155 bp,进行了基因测序和遗传进化分析,序列同源性分析确证该毒株属SADS-CoV,命名SADS-CoVHN17。

甘草酸通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抗猪急性腹泻综合症冠状病毒感染的研究

猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠上皮细胞(IPI-2I)预处理2 h并感染不同浓度的SADS-CoV后,分别经western blot和TCID_(50)检测,结果显示N蛋白的表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在体外能够抑制SADS-CoV的感染。利用不同浓度GLY对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后,感染灭活的SADS-CoV,western blot结果显示在GLY浓度为0.8 mmol/L时,N蛋白表达量显著减少,表明GLY能够抑制该病毒的侵入。选取0.4 mmol/L GLY处理细胞,再感染SADS-CoV后2 h、6 h、12 h收取细胞样品经western blot检测,结果显示各时间点N蛋白表达量均显著减少,表明GLY对该病毒的复制抑制效果显著。GLY是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的竞争性抑制剂,而HMGB1的受体主要有TLR4和RAGE,因此构建了HMGB1关键性位点(C^(45)S、C^(106)S、C^(45/106)S)突变的质粒和RAGE受体的siRNA,分别转染Vero E6细胞并感染SADS-CoV,收获上清液和细胞样品,利用western blot和TCID_(50)检测。结果显示,N蛋白表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在SADS-CoV感染时通过影响HMGB1与TLR4和RAGE的结合而发挥功能。为了进一步探究GLY发挥作用的信号通路,分别将SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I细胞,收获细胞样品,利用western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的变化,结果显示p-p38、p-JNK、p-ERK表达量在感染早期和晚期上调,表明SADS-CoV感染激活了MAPK通路。利用不同浓度的GLY和TLR4抑制剂TAK对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后感染SADS-CoV,收获蛋白样品,western blot结果显示p-JNK和N蛋白表达量显著减少,其他蛋白无明显变化,表明GLY和TAK调控JNK的磷酸化,而不能调控p38和ERK的磷酸化。利用HMGB1中和抗体预处理Vero E6细胞、将HMGB1的siRNA以及构建的HMGB1关键位点突变的真核表达质粒分别转染Vero E6细胞后感染SADS-CoV,收获上述细胞样品,western blot结果显示p-JNK的表达量均减少,表明HMGB1影响了JNK的磷酸化;利用不同浓度的JNK抑制剂SP600125对Vero E6和IPI-2I预处理2 h,再感染SADS-CoV,利用western blot、TCID_(50)和IFA检测,结果显示N蛋白表达量及病毒滴度均下降且病毒复制减少,表明SP600125抑制了病毒的复制。综上所述,本研究首次证实GLY主要通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抑制SADS-CoV的体外复制,该通路的发现为研究抗SADS-CoV的新型药物提供了数据支持。

一起猪急性腹泻综合征的防治报告

报告了一起猪急性腹泻综合征(SADS)的流行病学、诊断和防治措施。说明SADS的传染性和致病力极强。采用自家组织灭活苗紧急预防和“封锁疫区,隔离消毒,扑灭病源,阻断传染渠道”是防治新发传染病的有效办法。