猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668~aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-I和MDA5的转录水平显著上调(P<0.05)。上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案。

生物信息学软件预测猪氨基肽酶N功能与结构

[目的]研究猪δ冠状病毒(PDCoV)入侵宿主细胞的感染机制,对其特异性受体猪氨基肽酶N基因编码蛋白功能与结构进行分析。[方法]通过多种生物信息学软件对pAPN蛋白的理化特性、亲疏水性、信号肽、跨膜区、糖基化位点、抗原表位、功能结构域及结构特征等进行预测分析。[结果]pAPN基因总长为2892 bp,编码963个氨基酸;其中,第35~963位氨基酸为膜外蛋白区,不含信号肽但包含2个典型的功能结构域。pAPN蛋白共有23个糖基化修饰位点和42个抗原表位。pAPN蛋白胞外域空间结构为二聚体,每个单体均可分为Ⅰ~Ⅳ4个结构域。[结论]该研究为了解pAPN蛋白与多种猪肠道冠状病毒相互作用的机制提供了思路。

猪氨基肽酶N不是猪德尔塔冠状病毒入侵宿主细胞的受体

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。为研究pAPN是否是PDCoV入侵宿主细胞的受体,本研究以TGEV为指示病毒,通过BHK-pAPN细胞感染试验、pAPNRNA干扰试验、ST细胞过表达pAPN试验、可溶性pAPN阻断试验,发现BHK-pAPN细胞是PDCoV非易感细胞,在易感细胞ST上沉默和过表达pAPN对PDCoV的增殖并无影响,可溶性pAPN不能阻止PDCoV感染ST细胞。这些研究结果表明pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,而且对PDCoV的增殖无影响。

猪氨基肽酶对PEDV感染作用的研究进展

近些年,猪流行性腹泻病毒(PEDV)的变异及分离一直是业界研究的热点,而猪氨基肽酶(pAPN)是否为PEDV感染的功能性受体一直备受争议。因此,论文就pAPN对PEDV作为受体及在PEDV感染中的作用的最新研究进展进行综述,以期阐明pAPN是否为PEDV的功能性受体并为PEDV的分离及后续研究提供参考。

猪流行性腹泻病毒的研究进展

猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给我国养猪业带来巨大经济损失。本文就近年来国内外对猪流行性腹泻病毒的研究进展(包括猪流行性腹泻病毒的结构蛋白和非结构蛋白、病毒的细胞培养特点、病毒感染的宿主受体、遗传变异和疫苗的开发等)进行综述,以期为猪流行性腹泻的预防和控制提供帮助。

pAPN基因敲除的IPEC-J2介导的TGEV感染特征分析

旨在探究猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪空肠上皮细胞系(intestinal porcine epithelial cell line J2,IPEC-J2)介导猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染的特征,为深入了解pAPN基因在TGEV感染过程中的作用机制提供理论依据。研究分为pAPN基因敲除IPEC-J2组(IPEC-J2-KO组)、野生型IPEC-J2组(IPEC-J2-WT组)和未接种TGEV的野生型IPEC-J2组(Mock组)3组,每组设置3个重复。首先通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)确定IPEC-J2接种TGEV毒株后收取细胞样品的最佳时间节点;其次,对IPEC-J2-KO进行了脱靶效应检测;然后,通过qPCR、蛋白免疫印迹(western blot,WB)、间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay,IFA)和50%组织细胞感染量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50))对接种TGEV的IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT及Mock进行感染特征分析;最后,通过WB检测IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT和Mock中NF-κB p65及其磷酸化蛋白pp65的表达情况。qPCR结果显示,接毒24 h是收集细胞样本以评估TGEV对IPEC-J2影响的最佳时间节点;脱靶分析结果显示,在IPEC-J2-KO中未检测到脱靶效应;病毒感染特征分析结果显示,与IPEC-J2-WT相比,IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均极显著降低(P<0.001),与Mock相比,IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均无显著差异(P>0.05),且IPEC-J2-KO内未检测到TGEV-N蛋白的表达;此外,与Mock相比,接种TGEV后,IPEC-J2-WT组NF-κB p65的磷酸化水平极显著上调(P<0.001),而IPEC-J2-KO组无显著差异(P>0.05)。本研究表明,IPEC-J2-KO可有效抵抗TGEV的感染,接种TGEV未影响IPEC-J2-KO中先天免疫相关信号通路中转录因子NF-κB的活性。该研究为IPEC-J2作为TGEV感染特征研究的细胞模型提供了理论依据,为阐明pAPN基因在TGEV入侵宿主细胞的机制及抗病猪新品种的研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒细胞受体研究进展

猪流行性腹泻病毒主要引起仔猪腹泻,发病率及病死率极高,严重影响养猪业的发展。而猪流行性腹泻病毒要感染仔猪,必须与宿主细胞表面的受体结合。目前已有研究证实,猪流行性腹泻病毒的细胞表面受体为猪氨基肽酶N(pAPN)。为了能更好的揭示pAPN在病毒感染过程中的机制,学者针对pAPN的结构、功能以及与病毒的感染结合区域进行了系统的研究,并开展了筛选pAPN结合短肽的工作,以此来探索病毒受体的阻断剂。为进一步研究猪流行性腹泻病毒感染机制及其细胞受体的作用提供参考,论文就目前pAPN最新研究进展进行了综述。

猪流行性腹泻病毒入侵细胞的研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)对新生仔猪危害极大,致死率可达90%,该病毒的变异株自2010年在中国乃至世界大规模暴发后,给养猪业造成巨大经济损失,本文总结了PEDV进入宿主细胞的研究进展,包括PEDV S蛋白在病毒入侵中的作用,以及PEDV在入侵过程中猪氨基肽酶N和唾液酸的作用,以此为PEDV致病机理的研究和该病防控提供基础和思路。

pEGFP-N1-pAPN-SPC段基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

为了构建能够表达猪pAPN-SPC段的真核细胞表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,并在Vero细胞中进行表达,本试验从猪肠道黏膜组织基因组中扩增出pAPN-SPC段基因,插到带有EGFP基因的真核细胞表达载体pEGFP-N1中,经Bam HⅠ及EcoRⅠ酶切鉴定正确后转染Vero细胞,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达,用RT-PCR和Western blot检测pAPN-SPC段基因的表达情况。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,且pAPN-SPC段在Vero细胞中得到了有效表达,为研究pAPN-SPC段蛋白对病毒增殖效果的影响奠定了基础。

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪回肠上皮(immortal pig intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体(pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5)共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞(片段敲除效率为15.5%),其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定

为研究猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是否作为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的细胞感染受体,通过转染技术,使PEDV非容许性细胞MDCK表达pAPN,并用PEDV感染转染细胞。结果发现转染的MDCK细胞可以感染PEDV,并且该病毒可以在转染细胞中连续传代。免疫荧光法鉴定存在病毒抗原。进一步实验证实,抗pAPN血清可以抑制PEDV感染转染的MDCK细胞。这些结果展示转染的MDCK细胞、pAPN表达及PEDV病毒复制之间存在直接联系,证明pAPN是PEDV的细胞感染受体之一。