猪流行性腹泻灭活疫苗佐剂筛选

为探究不同佐剂对猪流行性腹泻灭活疫苗免疫效果的影响,选用水包油佐剂A(O/W)、油包水佐剂B(W/O)和双相佐剂C(W/O/W)3种不同佐剂配制疫苗,分别接种3~5日龄仔猪后攻毒,综合评价不同佐剂的免疫效果。结果显示:A、B佐剂组疫苗免疫猪的抗体水平低于C佐剂组;攻毒后进行猪流行性腹泻病毒检测发现,仅C佐剂组试验猪全部呈阴性;剖检所有疫苗免疫组试验猪均未发现脏器病变。结果说明:双相佐剂制备的灭活疫苗免疫效果明显优于水包油和油包水佐剂疫苗,且安全性较高,可优先选择双相佐剂制备猪流行性腹泻灭活疫苗。本研究为猪流行性腹泻疫苗制备、生产提供了技术支撑。

猪流行性腹泻活疫苗与灭活疫苗免疫优劣势分析

猪流行性腹泻(PED)疫苗主要有活疫苗和灭活疫苗两种。PED活疫苗具有免疫效果好、免疫期长、适应性强等优势,而灭活疫苗则具有安全性高、稳定性好、预防效果稳定等优势。在选择疫苗时,需要综合考虑疫苗的特点、免疫效果、病情严重程度、养殖环境等因素,本文综述了两种疫苗的优劣,以便同行可以借鉴,以达到最好的预防效果。

猪流行性腹泻活疫苗(PEDV SHBS-ΔORF3株)对非靶动物的安全性试验

为了检验猪流行性腹泻活疫苗(PEDV SHBS-ΔORF3株)对非靶动物的安全性,用批次为201901、201902、201903疫苗分别接种小鼠和豚鼠,观察动物是否发生局部或全身不良反应。结果表明,接种小鼠和豚鼠均未出现不良反应,用猪流行性腹泻活疫苗(PEDV SHBS-ΔORF3株)接种非靶动物小鼠和豚鼠是安全的。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗耐热保护技术的研究

疫苗保护剂及其冻干工艺是影响疫苗效果的重要因素,对疫苗保存、运输及免疫效果有很大影响。为提高疫苗质量,在常规保护剂(明胶、蔗糖)基础上添加卡波姆、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮等基质,组成新型保护剂,分别在病毒液保存和疫苗冻干过程添加,并评价其病毒保护效果。结果表明:在半成品病毒液储存时加入10%新型保护剂,可使半成品保存期由原来的2个月延长至12个月。采用新型保护剂制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗,溶解性显著优于常规保护剂活疫苗,保存期由原来-20℃保存18个月提高到2~8℃保存36个月,且病毒活性及攻毒保护效力均优于原工艺产品,实现了储运过程中疫苗的冷藏储运,提升了疫苗的应用效果。

猪流行性腹泻治疗药物及疫苗研究进展

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是危害养猪业发展的重要病原微生物之一,PEDV可在猪群中快速传播,使猪群大面积的感染并且爆发猪流行性腹泻(PED)。感染猪群随年龄的不同呈现不同程度的临床症状,其中新生仔猪的症状尤为明显。PEDV可破坏感染仔猪的消化系统,造成其食欲不振,呕吐、腹泻、脱水等临床症状,且患有PED在仔猪死亡率极高,仔猪的大量死亡对生猪养殖产业造成极其严重的经济损失。目前预防该病的主要手段为生物安全防控及疫苗免疫注射,对PEDV产生抑制作用的药物还在积极的研发中。就目前药物对PEDV的抑制多数是在细胞感染病毒之前,如番茄碱、Griffithsin(GRFT)。该文对目前在实验中对PEDV产生一定的抑制作用的药物进行阐述,并对PED疫苗的研究进展进行简要总结。

猪流行性腹泻疫苗研究进展

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,具有4个主要结构蛋白、16个非结构蛋白和1个辅助蛋白ORF3。自2010年以来,该病毒变异株传播范围不断扩大,流行趋势日益复杂,经典毒株(CV777)相关疫苗已无法提供有效保护。因此,开发更加安全、有效的疫苗已迫在眉睫。灭活疫苗安全性高,但需多次接种且保护效果不佳;弱毒疫苗免疫原性良好,但存在毒力返祖风险;亚单位疫苗不携带病毒其他蛋白结构,使用安全、价格便宜,但其免疫原性差;重组病毒活载体疫苗可诱导产生特异性免疫反应,但安全性不足;重组细菌活载体疫苗能口服刺激机体黏膜免疫,并且载体具有佐剂作用,但其免疫效率不高;转基因植物疫苗安全稳定,但表达量低且研发周期长;核酸疫苗研发周期短、灵活性高,但安全性不高、外源基因易与宿主基因重组。随着相关研究的深入,各类疫苗研究已取得重要研究成果。笔者就PED灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗、重组细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗进行综述,以期为PED的防治和新型疫苗研发提供参考。

利用反向遗传学技术开发猪流行性腹泻减毒活疫苗的研究进展

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的接触性肠道传染病,严重威胁全球养猪业健康发展。疫苗接种是防控该病最有效的方法。虽然已开发出多款疫苗用于PED防控,但这些疫苗对PEDV强毒株攻击的保护效力仍不尽理想。PEDV反向遗传学技术的建立为PED疫苗研发提供了新的工具。笔者在回顾PEDV反向遗传学和病毒毒力相关蛋白研究进展的基础上,讨论了如何利用反向遗传学技术构建安全、有效且遗传稳定的PED减毒活疫苗候选毒株,并对PED减毒活疫苗的研究作一简要展望,旨在为PED减毒活疫苗的研发提供参考。

猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗的研制

旨在对疑似猪流行性腹泻(PED)患猪的病料进行病毒分离,并制备灭活疫苗。从因腹泻病死的7日龄内仔猪的小肠组织及内容物中,分离出1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),命名为PEDV-GS。用Vero细胞对病毒进行扩增,病毒液中加入终浓度为0.7 mg/mL甲醛,28℃灭活48 h,加入ISA 61 VG佐剂进行乳化,经稳定性、安全性和效力试验,初步研制出猪流行性腹泻的流行毒株灭活疫苗。疫苗免疫妊娠母猪后对仔猪进行母源中和抗体检测、安全性和有效性试验。结果表明,制备的猪流行性腹泻灭活疫苗稳定性和黏度检测都合格,且对仔猪安全有效,对妊娠母猪产仔数量及质量无影响,其被动免疫抗体至少持续到仔猪产后28 d。试验成功制备了具有安全性和高保护率的猪流行性腹泻灭活疫苗。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗预防效果观察

猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻是一个全球性的问题,长期一直困扰着养猪业的发展,它们不仅直接威胁着仔猪的生长发育,而且也是仔猪饲养管理工作中的重点和难点,特别是冬春季节，天气骤变，更容易促发这两种疫病。

猪流行性腹泻病毒全病毒灭活疫苗量效关系研究

本研究旨在探索猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)灭活疫苗不同抗原含量对仔猪感染的保护作用。测定不同浓缩倍数PEDV感染性病毒粒子数和病毒粒子总数,用不同浓缩倍数抗原分别制备灭活疫苗免疫小鼠,利用ELISA抗体检测方法、中和试验、ELISPOT方法测定体液免疫与细胞免疫产生情况,筛选合适抗原含量疫苗进行仔猪免疫并测定抗体,利用攻毒试验研究浓缩疫苗与保护之间的关系。结果显示,当抗原含量达8×10^(6) pfu·mL^(-1)以上时,灭活疫苗能有效刺激小鼠产生体液免疫及细胞免疫。以2 mL含8×10^(6) pfu·mL^(-1)抗原的灭活PEDV疫苗免疫仔猪可抵抗PEDV攻毒引起的腹泻及连续排毒,相较于总病毒粒子数,感染性病毒粒子数与抗体产生呈显著相关(r=0.9981),中和效价与仔猪保护呈显著相关性(|r|=0.9747)。PEDV灭活疫苗可以提供良好的免疫保护,其中感染性病毒数量是提升抗体水平的关键因子,抗体滴度作为一项体液免疫的指标是判断免疫保护的重要参考。

一株变异型猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其灭活疫苗的免疫效力试验

本研究旨在分离猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异株,通过悬浮培养工艺制备成高效价的PEDV灭活疫苗。2017年从中国多个规模化猪场采集腹泻病死仔猪的小肠及其内容物200份,通过RT-PCR方法进行PEDV检测并测序,筛选一株PEDV变异株,将其在2 L反应器里悬浮培养的Vero细胞上进行病毒分离与传代培养,收获的病毒液鉴定后测定TCID50,经甲醛灭活后加入氢氧化铝胶佐剂配制成PEDV灭活疫苗,对其物理性状、稳定性、黏度、无菌等进行检验,检验合格后免疫妊娠母猪及所产仔猪,对其安全性和免疫效力进行研究。结果显示,200份病料中有86份为PEDV阳性,将筛选的PEDV变异株病料在Vero细胞上传至第5代时出现细胞病变,传至第10代收获病毒液,经鉴定后确定为PEDV变异毒株,并命名为PEDV-GF10株。收获的病毒液浓缩后测得病毒滴度可达1×108.0 TCID50/mL。疫苗检验合格后在母猪产前40和25 d时试验组后海穴肌内注射4 mL疫苗,空白组不免疫,结果显示试验组与空白组母猪的生产情况无明显差异,所产3日龄仔猪分别免疫不同剂量后体温无显著差异,表明该疫苗对母猪和仔猪均安全性良好。随机挑选试验组与空白组母猪所产3日龄仔猪各20头,分别口服4 mL PEDV-F10病毒培养物,空白组母猪所产仔猪在攻毒24 h后PEDV发病率为100%,抗体均为阴性;试验组母猪所产仔猪只有10%出现了轻微的腹泻症状,仔猪获得了高达90%保护率,且仔猪被动免疫后抗体能持续至35 d以上。以上结果表明,PEDV-GF10变异株通过悬浮细胞培养后病毒滴度显著提高,研制的PEDV-GF10株灭活疫苗安全有效,能够对中国的PEDV变异株达到有效防控,为国内PED防控提供了理论依据。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

猪流行性腹泻病毒灭活疫苗临床免疫效果评价

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起猪的腹泻、呕吐、脱水及对仔猪高致死率的一种接触性肠道传染病,猪即使耐过也会降低经济效益。20世纪80年代初PED在我国陆续发生,目前不同阶段不同品系的猪只,对此病均有高度易感性,仔猪死亡率高达80%~100%。自2010年末开始,我国猪场陆续暴发了由PEDV变异毒株引起的“顽固性腹泻”疫情,严重影响我国养猪业健康发展,给我国养猪业造成巨大经济损失。由于PED在现阶段未有特效药能够治疗,在养殖管理中,仔猪免疫防治工作尤为重要。

免疫接种途径及佐剂对猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗免疫效果的影响

猪传染性胃肠炎（TGE）和猪流行性腹泻（PED）是两种严重威胁养猪业的病毒性传染病，其病原猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）同属于冠状病毒，形态相似，繁殖的靶器官相同，引起猪呕吐、脱水及水样腹泻，对仔猪具有高度致死率[1-3]。

猪流行性腹泻病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】利用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)核衣壳蛋白(N),并制备具有高效价和特异性强的多克隆抗体。【方法】利用生物信息学工具分析PEDV N蛋白氨基酸序列,并预测其抗原性;利用原核表达载体pColdⅠ诱导表达重组N蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用兔多抗制备佐剂与纯化后的重组N蛋白混合后免疫新西兰白兔,收集血清制备多克隆抗体。利用间接ELISA法测定重组N蛋白多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】生物信息学预测结果显示,N蛋白不含信号肽和跨膜结构,具有良好的抗原性和溶解度。SDS-PAGE电泳结果显示,重组N蛋白大小约为58 ku,主要以可溶性蛋白存在;Western blotting结果显示,该蛋白能与抗His标签的鼠源单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA结果显示,多克隆抗体效价可达1∶204800;Western blotting结果表明,抗体稀释度为1∶5000时能特异性识别重组N蛋白及PEDV感染后的Vero细胞样品中的N蛋白;IFA结果显示,当稀释度为1∶1000时,该抗体能有效识别PEDV感染细胞样品中的N蛋白。【结论】本研究成功制备了效价高和特异性好的兔抗N蛋白多克隆抗体,为深入研究PEDV N蛋白的功能、了解PEDV复制机制和病毒-宿主细胞间的互作提供试验材料,为开发PEDV诊断和检测方法奠定基础。

干扰素刺激基因ISG15对猪流行性腹泻病毒复制的作用及机制分析

【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染细胞不同时间点PEDV M基因mRNA和N蛋白表达量,并从RNA和蛋白水平检测ISG15表达变化;分别构建猪ISG15基因干扰和过表达细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验检测ISG15基因表达对PEDV复制水平的影响;对ISG15基因过表达前后进行转录组测序分析,筛选其下游调控基因及信号通路。【结果】ISG15基因在仔猪肠道组织中特异性高表达,其中空肠和回肠中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);PEDV感染组十二指肠、空肠及回肠中ISG15基因表达量显著或极显著高于健康组(P<0.05;P<0.01);M基因mRNA和N蛋白表达量出现上升趋势,与0 h相比,ISG15基因表达水平在24 h出现极显著上调(P<0.01);ISG15基因过表达后PEDV复制出现显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而ISG15基因干扰后PEDV复制出现极显著上调(P<0.01);转录组测序发现,过表达ISG15基因前后存在1 532个差异表达基因,且其主要富集在自噬、MAPK、内吞等信号通路中。【结论】本研究揭示了PEDV感染过程中ISG15基因的调控功能及作用机制,发现ISG15基因上调可显著抑制PEDV复制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识。

猪流行性腹泻灭活疫苗的临床免疫效果评价

为防控猪流行性腹泻,筛选可靠的免疫方式,研究采用与猪流行性腹泻病毒毒株序列同源性最高的猪流行性腹泻灭活疫苗进行紧急免疫,于产前30、15 d分别免疫妊娠母猪,并检测免疫前后母猪的血清和初乳中猪流行性腹泻病毒中和抗体及免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)特异性抗体。结果表明,免疫后母猪的血清和初乳均产生高水平且稳定的中和抗体及IgG、IgA特异性抗体,所产仔猪无腹泻临床症状。研究表明,灭活疫苗可应用于猪流行性腹泻的紧急免疫防控,2针灭活疫苗的免疫方式可有效防控猪流行性腹泻。

猪流行性腹泻疫苗研究和开发进展

猪流行性腹泻是危害养猪业的重要疫病之一,在世界各地的养猪业中均有暴发流行,近年来在全国猪场出现了大范围的暴发。为了降低猪流行性腹泻造成的巨大损失,世界各国的猪病研究人员一直致力于研发安全、高效的PED疫苗。通过从灭活疫苗、活疫苗和基因工程疫苗等方面对国内外的PED疫苗研究和开发进展进行综述,汇总了国内外近几年来审批许可的PED商品化新疫苗和正在进行临床试验的PED疫苗,以及疫苗研发的新技术,为开发更好的PED疫苗产品提供参考和前景展望。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护相关性研究

以实验室试制的3批猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(JL株+HN-1株),对3~5日龄仔猪进行接种,免疫后14、21 d分别采血,分离血清,检测各组仔猪的TGEV、PEDV中和抗体,并以TGEV和PEDV强毒进行攻毒。结果表明,中和抗体效价的升高,对仔猪的保护率也随之升高,两者呈正相关。当血清中TGEV中和抗体达到132时,可以完全保护仔猪抵抗TGEV强毒的攻击;PEDV中和抗体达到116时,可以完全保护仔猪抵抗PEDV强毒的攻击。