二乙烯亚胺在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株灭活疫苗中的应用

[目的]通过甲醛和二乙烯亚胺对猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株的灭活效果比较,获得一种适合猪流行性腹泻病毒疫苗灭活的生产工艺。[方法]将二乙烯亚胺接种小白鼠观察二乙烯亚胺的毒性。分别使用甲醛和二乙烯亚胺,在室温条件下灭活PEDV-WN株病毒液8、12、16、20和24 h,取灭活后的病毒液接种生长良好的单层Vero细胞,进行灭活效果的检验;同时,取灭活检验合格的病毒液进行无菌检验。灭活合格的病毒液乳化配苗,进行安全性和效力试验。[结果]接种二乙烯亚胺的小白鼠28 d均健活,状态良好;甲醛体积分数为0.3%,灭活16 h可使病毒液完全灭活;二乙烯亚胺浓度为0.010 mol/L,灭活12 h可使病毒液完全灭活;灭活合格的病毒液无菌;将不同方法灭活后的病毒液乳化配苗,接种3~5日龄的仔猪,安全性较好,未观察到不良反应,然后用PEDV-WN毒株攻毒,二乙烯亚胺灭活制备的疫苗比甲醛灭活制备的疫苗保护率高。[结论]在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株病毒液中加入浓度为0.010 mol/L的二乙烯亚胺,在室温灭活12 h,可使病毒完全灭活,且制备的疫苗安全性好,保护率高。

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID_(50))为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^(7).0TCID_(50)/mL免疫怀孕75~90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明:猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10^(6)个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10^(6)个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量可稳定达到1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在15L生物反应器上的最适培养条件为pH值7.0~7.2、DO值50%、转速80~100 r/min,培养36h收获的病毒液含量可稳定在1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;在50L生物反应器上放大培养收获的病毒液含量为1×10^(7).8TCID_(50)/mL。母猪和仔猪中和抗体效价均≥1∶32,免疫保护力为100%。说明本试验条件下成功建立并优化了生物反应器全悬浮培养制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,生产的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的免疫原性较好。

藏香猪流行性腹泻病毒的PCR检测及毒株分型

为明确四川省凉山彝族自治州某藏香猪规模化养殖场哺乳仔猪腹泻的病因,试验采集腹泻仔猪的粪便和肠道样品进行实验室病原学诊断,采用RT-PCR方法检测4种常见肠道病毒的感染情况。检测结果显示,猪流行性腹泻病病毒(PEDV)检测为阳性,猪delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒3种病毒均为阴性。进一步采用RT-PCR扩增该毒株S1基因序列并测序。结果显示,该毒株与G2型变异毒株同源性最高,与其他基因型毒株同源性相对较低,因此判定该猪场仔猪发病是由猪流行性腹泻病毒G2型变异毒株感染所致。对病猪进行紧急免疫接种、治疗、消毒等综合防控措施,控制住了疫病的蔓延和发展。总结此次猪流行性腹泻病的治疗经验,为养猪场对该疫病的治疗和防控提供借鉴。

猪流行性腹泻病毒PEDV SD株的分离及体外3D肠道类器官感染模型建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种主要感染仔猪小肠的肠道冠状病毒。本研究旨在建立一种用于PEDV体外研究的仔猪小肠类器官模型。首先从PEDV发病猪场的临床仔猪腹泻样品中分离PEDV并进行全基因组测序,结果显示成功分离1株PEDV,命名为PEDV SD株。另外采用肠道类器官的培养技术,从10日龄健康仔猪小肠中分离小肠隐窝组织,经过体外培养7 d左右分化成具有肠道隐窝结构的猪小肠类器官,并能进行连续传代。然后将分离的PEDV SD株感染传代培养的猪小肠道类器官,通过间接免疫荧光试验显示PEDV可以很好地感染猪小肠道类器官,表明成功建立了PEDV感染肠道类器官的模型。猪小肠类器官感染模型可以在体外很好地重现PEDV感染肠道细胞的复杂结构的过程,为深入研究PEDV的致病机制提供一种新的可再生的体外研究模型。

猪流行性腹泻病毒YL株分离鉴定及仔猪感染试验

从腹泻仔猪肠道组织中分离获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)地方分离株,并对其致病性进行初步分析。对陕西某养殖场采集有腹泻症状3~5日龄仔猪的十二指肠,经RT-PCR检测为PEDV核酸阳性。将阳性样品处理后接种Vero细胞进行病毒分离,并对分离毒株进行病毒含量测定、致病性试验。结果显示,分离到1株PEDV毒株(命名为YL株)。将分离的PEDV病毒液以不同滴度口服接种健康仔猪,2.0 mL/头,发现10^(5.5)TCID_(50)/mL剂量组接种1日后,100%(3/3)试验猪出现腹泻症状。

猪流行性腹泻病毒CH/SCJY/2022株的分离鉴定及遗传进化分析

2022年四川省简阳地区某规模化猪场仔猪发生严重腹泻甚至死亡,疑似猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染。为确定病原并了解其遗传进化特征,试验无菌采集病死腹泻仔猪小肠组织样本,提取RNA后采用RT-PCR方法对病原进行检测,并对病毒进行分离和半数组织培养感染剂量(TCID_(50))测定、间接免疫荧光试验、全基因组测序和遗传进化分析。结果表明:腹泻仔猪小肠组织样本为PEDV阳性,小肠组织过滤上清液接种Vero细胞盲传至第3代出现致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),盲传至第9代时出现稳定的CPE,第9代病毒液的TCID_(50)为1×10^(-5.2)/0.1 mL;在以鼠源抗PEDV-S蛋白单克隆抗体为一抗、FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗的间接免疫荧光试验中,接种分离毒株的Vero细胞呈现特异性绿色荧光,未接种分离毒株的Vero细胞无特异性绿色荧光。将分离毒株命名为CH/SCJY/2022。经PCR分段扩增、测序、拼接后得到CH/SCJY/2022株全基因组序列,大小为28038 bp。CH/SCJY/2022株S基因、ORF3基因、M基因、N基因与参考毒株(CV777、AJ1102、LW/L、virulent DR13、LZC)核苷酸相似性分别为93.11%~97.71%、95.41%~98.37%、96.62%~98.09%、94.72%~96.38%。CH/SCJY/2022株全基因组序列与30株PEDV参考毒株核苷酸相似性为96.0%~98.9%,其中与强毒变异株YC2014的相似性最高(98.9%),与韩国毒株SM98的相似性最低(96.0%),与疫苗毒株CV777、AJ1102的相似性分别为96.4%和98.3%。基于全基因组序列构建的遗传进化树中可见CH/SCJY/2022株与CH/SCZY103/2017位于同一小分支,亲缘关系最近,属于GⅡb基因亚群;与疫苗毒株LW/L、AJ1102、XJ-DB2、CV777、attenuated DR13的亲缘关系较远。与参考毒株(attenuated DR13、LW/L、CV777、AJ1102、XJ-DB2)相比,CH/SCJY/2022株S蛋白氨基酸序列存在6处特有的氨基酸位点突变,分别为N139D、I289M、R492K、F541L、L1000M、S1080L。说明试验成功从该养猪场腹泻仔猪小肠组织样本中分离鉴定到1株PEDV GⅡb亚群变异株,并获得了该毒株的全基因组序列,具有独特的分子特征。

猪流行性腹泻病毒贵州流行株N基因的克隆、测序与生物信息学分析

为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明:PEDV-GZ2022株N基因大小约为1364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%~99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、14个苏氨酸及3个酪氨酸可能被磷酸化,并且抗原指数较好。说明PEDV-GZ2022株为GⅡ-b变异株,PEDV-GZ2022 N蛋白可能具有良好的抗原性,可以作为潜在的诊断抗原。

猪流行性腹泻病毒变异毒株中和表位区S10原核表达及多克隆抗体的制备

试验对猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株S1的S10表位区进行表达,并制备抗S10蛋白多克隆抗体。将S10区基因连接至原核表达载体pET-32a(+),经大肠杆菌原核表达系统成功表达pET-32a-S10重组蛋白,重组蛋白分子量约为41 kDa,利用Ni柱进行亲和纯化后浓度为2.01mg·mL^(-1)。纯化的重组蛋白经Western blot鉴定后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并收集小鼠血清,利用间接ELISA方法检测血清中抗体效价可达到1∶12800,该抗体可以结合S10重组蛋白和天然PEDV HM2017毒株。研究成功制备了良好免疫原性的PEDV S10蛋白多克隆抗体,为进一步研究S1蛋白及PEDV诊断方法的建立奠定基础。

一株猪流行性腹泻病毒强毒株的分离与鉴定

为了掌握猪流行性腹泻病毒(PEDV)最新流行毒株的病原特征与致病性,开展了PEDV的分离与鉴定。将PEDV阳性病料样品接种Vero细胞连续盲传,分离PEDV流行毒株,并开展了分离毒株的培养特性、全基因组序列分析和仔猪致病性评价。结果显示:传至第3代(P3)分离出一株病毒,病毒在细胞上形成典型的“合胞体”样病变;电镜下病毒大小60~110 nm;P10到P35代滴度从10^(4.7)TCID_(50)·mL^(-1)升至10^(6.43)TCID_(50)·mL^(-1);CHN-SC2021(P5)基因组全长28014 bp(GenBank收录号:OM505025.1),与中国地区、欧美地区、亚洲其他国家毒株的相似性分别为99.16%~96.32%、99.01%~96.57%、98.94%~96.33%;系统进化树显示CHN-SC2021株与江西CH/JXJA/2017(MF375374.1)、河南CH/HNAY/2015(KT199103.1)、CH/HNKF-16(KY649107.1)毒株亲缘关系较近,属于GⅡa型毒株。S基因序列与参考毒株相似度在98.7%~93.4%。将CHN-SC2021病毒液以每头3 mL 10~5 TCID_(50)·mL^(-1)的剂量口服感染6日龄哺乳仔猪,12 h开始出现食欲不振,20 h时呕吐,24 h出现剧烈呕吐和黄色水样腹泻;剖检病变主要是胃肠臌气、空肠和回肠透明;组织病变显示各肠段均有不同程度的肠绒毛病变、脱落、结缔组织疏松、黏膜肌层与肌层间距增宽等;免疫组化结果显示小肠各段均有病毒,回肠中病毒最多。本研究分离获得一株GⅡa型的PEDV强毒株,有助于丰富我国PEDV的流行毒株信息及为临床防控提供参考。

一株猪流行性腹泻病毒变异株的分离、鉴定与全基因组序列分析

江苏省某猪场疑似发生猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),采集病料后,经RT-PCR检测PEDV呈阳性。病毒感染Vero细胞能够引起明显的细胞病变,间接免疫荧光鉴定结果显示病毒感染细胞后能被抗PEDV N蛋白的特异性单克隆抗体识别。通过全基因组序列分析,鉴定该毒株为PEDV G2b亚型变异株,并将其命名为PEDV JS-B株。

1株高致病性基因2型猪流行性腹泻病毒毒株的分离鉴定

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的生物学特性,采集仔猪临床腹泻病料进行病毒分离,结果显示,接种病料的Vero细胞连续盲传3代后可观察到明显的细胞病变,通过间接免疫荧光试验确定导致细胞病变的病毒为PEDV,毒株命名为JMS。通过RT-PCR扩增JMS毒株S基因并进行系统进化树分析发现,JMS属于GⅡb基因型。采用500 TCID50(半数组织细胞感染量)的剂量对3日龄仔猪进行攻毒发现,攻毒仔猪表现出严重的临床症状,并在48 h内死亡,致死率为100%。对仔猪剖检和病理组织切片检查发现,攻毒仔猪肠壁变薄,绒毛结构破损、变短甚至脱落。综上,本研究分离到1株高致病性PEDV毒株,为后续探究PEDV流行毒株生物学特性以及相关疫苗研发奠定了基础。

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其ORF3和S基因序列分析

为了探明辽宁省沈阳市某猪场仔猪发生腹泻的病原及其遗传进化特征,试验首先对该猪场发生腹泻的仔猪腹腔进行剖检,记录小肠组织的病理变化;收集病理变化较明显的组织进行切片和H.E.染色,观察并记录结果;取病料后提取病毒核酸,用猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪丁型冠状病毒(Porcine delta coronavirus,PDCoV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测引物进行RT-PCR检测;然后进行病毒的分离、致细胞病变效应(CPE)观察、传代、间接免疫荧光试验与效价的测定;最后对病毒的关键基因进行PCR扩增及遗传进化分析。结果表明:腹泻仔猪小肠肠壁变薄、胀满、充满水样内容物,肠系膜呈树枝状充血,肠系膜淋巴结水肿;十二指肠肠绒毛破碎、细胞坏死,固有层细胞充血;空肠肠绒毛萎缩变短,上皮细胞空泡样变性,少量淋巴细胞浸润,与PEDV感染猪只的肠组织病理变化相同。腹泻仔猪病料组织PEDV核酸检测结果为阳性,其他4种病原检测结果均为阴性。将盲传6代的病毒培养液接种于Vero细胞,培养48 h后出现明显的CPE,以PEDV N特异性单克隆抗体为一抗的间接免疫荧光试验出现特异性的绿色荧光,经测定病毒效价为1×10~(5.83)TCID_(50)/mL。将分离毒株命名为CH/XF1.C.3/2020,其ORF3基因和S基因与国内外PEDV参考株的相似性分别为89.9%~99.6%和92.7%~98.4%。该毒株与近年来分离的国内外的PEDV变异株亲缘关系较近,与经典毒株CV777(GenBank登录号为KT323979.1)的亲缘关系较远,属于GⅡ/GⅡa型PEDV。说明本试验成功分离到一株GⅡ/GⅡa型PEDV,该毒株为该猪场仔猪发生腹泻的病原。

猪流行性腹泻病毒SCYA2204株的基因克隆及测序分析

为了解四川省雅安地区流行的PEDV的基因特征及遗传变异情况,本研究通过病毒RNA提取、RT-PCR、基因克隆及测序等方法获得一株PEDV SCYA2204的基因序列,利用生物信息学分析软件分析其核苷酸序列,并推导氨基酸的变异性和遗传进化特征。结果显示:SCYA2204是G2b亚型毒株,其S基因、ORF3基因、E基因、M基因、N基因与参考毒株的核苷酸序列同源性分别为92.5%~99.2%、96.0%~100%、97.0%~100%、97.4%~99.7%、95.2%~99.9%;由S基因构建的遗传进化树显示SCYA2204与5株四川往年流行毒株聚成一支,亲缘关系密切;与PEDV国内常用疫苗株CV777、AJ1102及四川往年流行毒株相比,SCYA2204 S蛋白存在10处氨基酸连续突变;与CV777和AJ1102比较,S蛋白核心中和表位共有2处氨基酸突变;此外,SCYA2204的S基因发生了重组事件,其主要亲本为G2b亚型的CH/SCXH/2018。上述研究表明,当前在雅安地区流行的PEDV毒株氨基酸序列发生了变异和重组,可能导致抗原性发生改变,影响现有疫苗的保护效力。

猪流行性腹泻病毒流行毒株对4周龄仔猪的致病性研究

本试验旨在评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株对4周龄仔猪的致病性。将60头4周龄PEDV抗原抗体阴性断奶仔猪分为4组,每组15头,第1、2、3组试验用猪逐头分别口服2.0 mL的PEDV毒株PEDV-FJ06、PEDV-0016和PEDV-TT;第4组作为阴性对照组(NC),逐头口服2.0 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)。攻毒后,PEDV-FJ06和PEDV-TT组试验用猪在1 d内即出现水样性腹泻,PEDV-0016组试验用猪在第2 d出现水样性腹泻,各组发病率分别为90%(PEDV-FJ06)、80%(PEDV-0016)、100%(PEDV-TT)和0%(NC)。试验用猪在攻毒后第1 d即可通过粪便排毒,排毒高峰期在感染后第2~7 d,至试验结束仍有部分猪持续排毒。攻毒后第3 d和第7 d攻毒各组平均日增重均显著低于阴性对照组(P<0.001),试验后期,随着临床症状减轻,被感染猪的健康状况逐步好转,平均日增重也略有恢复,但仍明显低于对照组。攻毒后第7、14和21 d,每组随机选取5头猪剖检,大体病理学检查可见肠腔扩张、肠壁变薄和肠系膜充血等;病变严重的试验用猪组织病理学检查,可见小肠绒毛严重萎缩、脱落,并伴有炎性细胞浸润。免疫组化结果显示,可在感染猪十二指肠、空肠和回肠绒毛上皮细胞胞质中检测到PEDV阳性信号,且攻毒后第7 d攻毒各组试验用猪的回肠组织PEDV免疫组化阳性率为100%。本试验研究表明PEDV-FJ06、PEDV-0016和PEDV-TT毒株对4周龄仔猪均具有较高的致病性,病毒感染后可迅速在小肠上皮细胞中增殖,造成小肠绒毛损伤,进而导致腹泻,并严重影响其平均日增重;PEDV感染后持续排毒,增加了PEDV传播风险。

一株猪流行性腹泻病毒的鉴定及S基因分析

为了解宜宾市猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组特征,本试验利用RT-PCR技术从腹泻仔猪肠道内含物中分离出一株感染宜宾市猪流行性腹泻病毒(PEDV)的株系,并将其命名为SCYB202212。通过RT-PCR方法对S基因进行扩增,对测序结果拼接并构建系统进化树。结果表明SCYB202212的S基因长度为4161 bp;系统发育树分析发现,SCYB202212与CH-HeN-ZLH-2022,SXSL,S2021株处于同一独立分支,属于GⅡ-a亚型。本研究有助于深入了解宜宾市PEDV分离毒株的分子特性,为后续该病的诊断试剂和疫苗开发提供依据。

CD44通过影响猪流行性腹泻病毒复制调节钠氢交换体3活性

本研究旨在研究CD44(cluster of differentiation 44)对感染猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中钠氢交换体3(NHE3)表达及膜转移的影响。以IPEC-J2为细胞模型,采用RT-qPCR和Western blot检测感染PEDV后不同时间点IPEC-J2细胞中NHE3和PEDV N表达量变化;转染质粒调控IPEC-J2中CD44表达后,采用TCID50和Western blot检测PEDV感染后不同时间点PEDV复制水平和NHE3蛋白表达变化,采用火焰原子吸收法检测IPEC-J2细胞内外Na^(+)浓度变化。转录组数据和细胞试验结果显示,与对照组相比,PEDV感染后IPEC-J2细胞中CD44蛋白表达水平和mRNA表达量均呈上调趋势,24~48 h内上升显著(P<0.05),而PEDV N蛋白表达水平在12~48 h内则呈显著下降趋势(P<0.05)。此外,CD44重组质粒转染试验结果显示,与PEDV感染组相比,过表达CD44后感染PEDV组细胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而干扰CD44后感染PEDV组细胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表达水平则显著上升(P<0.05)。以上结果表明,高表达CD44具有抑制PEDV复制的作用,干扰CD44后PEDV复制增多。同时,为研究PEDV感染情况下,CD44是否参与了IPEC-J2细胞中NHE3表达的调节,采用Western blot和火焰原子吸收法检测了调节CD44后膜NHE3蛋白的表达水平和细胞内外Na^(+)浓度。结果表明,过表达CD44显著促进了膜NHE3蛋白的表达和活性(P<0.05),细胞内外Na^(+)浓度逐渐恢复正常水平。相反,干扰CD44显著降低了膜NHE3蛋白的表达和活性(P<0.05),细胞内外Na^(+)浓度呈现失衡状态。结果提示,CD44可能是缓解PEDV引发仔猪腹泻的潜在治疗靶点,它通过抑制IPEC-J2细胞中PEDV的复制来增加转移至质膜上的NHE3数量,从而维持细胞内外Na^(+)运转平衡。

猪流行性腹泻病毒微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法的建立

为了建立简便快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量RT-qPCR检测方法,根据GenBank数据库公布的猪流行性腹泻病毒囊膜蛋白E基因,设计特异性引物和探针结合微芯片技术,建立微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法。该方法除对PEDV检测为阳性外,对与其同源性较近的致病病毒的检测均为阴性;最低检测限为1 copies/μL,常规荧光RT-qPCR检测限为10 copies/μL。批内、批间重复性试验表明,Ct值变异系数均在2%以内,可对PEDV临床样本进行检测。建立的检测方法特异性好、敏感性高、检测时间短且重复性好,适用于临床检测。

猪流行性腹泻病毒基因组和诊断方法研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),是一种急性、高度接触性、高发病率和高致死率的猪肠道传染病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。深入了解PEDV的基因组结构和功能是研制高效安全疫苗的关键。通过解析PEDV的基因组结构、编码的蛋白质以及其与宿主细胞的相互作用,研究人员可以设计出更具针对性的疫苗候选物。诊断技术的进步对于PED的早期诊断及免疫后应答水平监测和评估至关重要。因此,综述了PEDV的基因组结构与功能(包括S、E、M、N、辅助蛋白和非结构蛋白)、血清学以及分子诊断方法[如酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、病毒中和(VN)和间接免疫荧光测定(IFA)、免疫层析试验(ICA)、荧光微球免疫测定(FMIA)、序列测定和聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)]的最新进展,旨在为建立快速有效的PEDV检测方法提供思路,并为临床上有效防控PED提供参考。

几种中药体外抗猪流行性腹泻病毒活性的研究

为探究蒲公英、板蓝根、泽泻、葛根、黄芩5种中药水提物体外抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的效果,本研究先将不同浓度中药液分别2倍倍比稀释后加入非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中,观察各药物对细胞生长状态的影响来确定各药物的最大安全浓度。结果显示,蒲公英、板蓝根、泽泻、葛根、黄芩的最大安全浓度分别为3.91 mg/m L、1.95 mg/m L、1.95 mg/m L、0.98 mg/m L、0.98 mg/m L。以药物最大安全浓度为初始浓度,2倍倍比稀释各药物,共6个浓度,采用先加药物后加病毒(阻断作用),先加病毒后加药物(抑制作用)、药物和病毒同时加入(杀灭作用)3种不同加药的方式,加入已铺满单层Vero细胞的96孔细胞培养板中,72 h后加入CCK-8溶液1 h后测定各孔的OD_(450nm)值,评估阻断作用、抑制作用、杀灭作用下各药物对PEDV抑制率最高的浓度。结果显示,5种药物在阻断作用、抑制作用、杀灭作用下对PEDV抑制率最高的浓度分别为3.91 mg/m L、1.95 mg/m L、1.95 mg/m L、0.98 mg/m L以及0.98 mg/m L。以上述对PEDV抑制率最高的药物浓度为试验浓度,重复上述3种加药方式,72 h后加入CCK-8溶液1 h后测定各孔的OD_(450nm)值,计算3种作用方式下各药物对PEDV的抑制率,筛选出对PEDV抑制率最高的药物。结果显示,各中药均可在体外抑制PEDV的感染,阻断作用下黄芩对PEDV的抑制率最高达138.10%,抑制作用下蒲公英对PEDV的抑制率最高达149.90%,杀灭作用下葛根对PEDV的抑制率最高达102.90%,且蒲公英和黄芩在3种作用方式下对PEDV的抑制率均高于80%。以上结果表明蒲公英和黄芩体外抗PEDV感染的效果最好,本研究首次证实5种中药对体外抗PEDV感染的效果,为中药治疗PED提供了参考依据。