猪流行性腹泻病毒S1基因遗传进化分析及蛋白结构预测

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科甲型冠状病毒属,可引起血清阴性新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水,死亡率较高。PEDV感染引起的猪流行性腹泻(PED)给欧洲和亚洲养猪业造成了重大的经济损失。地方性PED是一个重大问题,多种PEDV潜在输入或变体的出现加剧了这一问题。为了解PEDV的流行与变异情况,应用生物信息学方法对50个PEDV毒株进行了遗传进化分析。结果表明,不同基因型PEDV S1基因具有稳定突变点,同一地域主要流行毒株具有相对遗传稳定性,2020年后我国流行毒株多为G2c基因群。本研究为进一步监测和分析我国猪群腹泻的流行病学及研究PEDV的遗传变异规律提供参考,同时为PED的防控和疫苗研发提供理论依据。

猪流行性腹泻病毒S1基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

本文以猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株FJzz1/2011株的S1蛋白的切割位点设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得S1基因,将其克隆至转移载体p Fast Bac HTA中,获得了重组质粒p Fast Bac HTA-S1,将该重组质粒转化E.coli DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒r Bacmid-S1,再将重组穿梭质粒r Bacmid-S1转染Sf9细胞,48 h后即可观察到明显的细胞病变。将收获的r Bac-S1-P1代病毒在Sf9细胞上连续传3代后,收获细胞培养物,分别用间接免疫荧光鉴定(indirect immunofluorescence assay,IFA)、SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,P3代重组病毒r Bac-S1感染的细胞均呈现亮绿色荧光,证实表达产物可以被PEDV阳性血清和抗S1蛋白的单抗特异性识别;SDS-PAGE电泳结果显示在大约120 k Da左右可观察到特异性条带;Western blot结果证实该蛋白可以被抗S1蛋白的特异性单抗识别。综上研究结果,证明利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功表达了PEDV的S1蛋白,为进一步研究PEDV S蛋白的抗原性奠定了基础。

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株(ZJ16NB6)与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%,氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。

猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及在腺病毒中的表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1基因在腺病毒中的表达,试验采用RT-PCR方法,获得S1目的基因序列,并将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,再与BJ5183细菌内的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得携带猪流行性腹泻病毒S1基因的重组腺病毒质粒pAd-S1;该重组质粒经PacⅠ酶切、转染AD-293细胞,获得具有感染性的重组腺病毒rAd-S1;病毒效价在传至第6代时可达到1×108.3TCID50/mL,同时经PCR检测,目的基因在重组腺病毒rAdS1传代过程中稳定存在;间接免疫荧光检测和Western-blot检测,rAd-S1在AD-293细胞中成功表达出分子质量约为100 ku猪流行性腹泻病毒S1蛋白。说明构建的重组腺病毒rAd-S1能够稳定地表达PEDV S1蛋白。

2016年黑龙江省猪流行性腹泻病毒S1基因的遗传变异分析

为了解2016年黑龙江省猪场内猪流行性腹泻病毒（PEDV）的流行与变异情况,试验利用RT-PCR方法对采自黑龙江省的29份腹泻仔猪的小肠组织样品进行检测,针对PEDV S1基因进行扩增及测序,构建系统进化树,并对其进行系统进化性分析和氨基酸序列插入或缺失突变分析。结果表明：10个S1基因测序成功,鉴定毒株间核苷酸序列同源性为96.2%-99.7%,推导出的氨基酸序列同源性为96.2%-99.5%;与已知的中国HGC-01-2015、FJ-FQ 2014野毒株和美国高致病性毒株USA/Colorado/2013同源性较高,而与经典毒株CV777、中国早期毒株同源性较低;以S1基因构建系统进化树,主要分为GⅠ群和GⅡ群,新鉴定的10株PEDV毒株均属于GⅡb亚群的non S-INDEL型毒株,与经典毒株CV777及亚洲其他地区毒株、欧洲毒株分属于不同亚群;鉴定毒株与亚洲地区常用疫苗株相比,存在相同的突变位点,并集中在S1蛋白的N末端结构域。

3株猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及序列分析

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可感染各阶段的猪,使患病动物出现水样腹泻、呕吐,并伴随厌食和精神沉郁等临床症状,对哺乳仔猪危害尤为严重。为了解河南某猪场PEDV流行毒株S1基因的变异情况,以江苏农牧科技职业学院动物药学院实验室保存的感染PEDV临床病料为样本,对其进行S1基因扩增、克隆以及序列分析。对S1基因的进化分析结果显示,该猪场PEDV分离株S1基因推导的氨基酸序列之间的同源性高达99%,BLAST搜索结果显示与AHCZ-2株的相似性最高,将获得序列与经典毒株CV777相比在第57位插入了4个氨基酸NQGV,在第134位插入1个氨基酸D,而在第157、158位缺失2个氨基酸,在中和表位区域共有11处氨基酸突变,与国内其他毒株均位于G2-b进化分支,研究结果为进一步掌握该地PEDV的流行毒株和毒力变异情况提供了理论依据。

广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆与序列分析

为研究广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的变异情况,于2012-2013年间从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪样本。通过PCR方法扩增到12个样本的PEDV的S1基因序列,并进行序列比对及遗传分析。结果 12个样本PEDV的S1基因序列之间的核苷酸同源性为91.1%-99.6%,氨基酸的同源性为88.5%-99.1%。12个样本PEDV的S1基因序列与国内参考毒株核苷酸的同源性为91.0%-99.9%,氨基酸的同源性为88.5%-99.7%。与国外参考毒株核苷酸的同源性为89.0%-99.7%,氨基酸的同源性为86.5%-99.4%。与经典毒株CV777的核苷酸同源性为91.0%-100.0%,氨基酸的同源性为88.3%-99.9%。其中,仅GD-HY的S1基因与CV777的同源性达100.0%,其他同源性较低。表明近年广东省的PEDV流行毒株以变异株为主,与疫苗株（CV777）的亲缘关系较远。

河北省一株猪流行性腹泻病毒S1基因的遗传变异与重组分析

为了解近年来河北地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行性和遗传变异性,试验采集河北省某发病猪场仔猪的小肠组织,提取RNA,对S1基因进行RT-PCR,对扩增的阳性产物进行克隆与测序,对测序结果进行同源性分析,对S1蛋白进行亲水性、表面可触性、抗原指标及T细胞基序分析,利用MEGA X 10.0.5软件对PEDV S1基因进行最大似然法(maximum likelihood, ML)遗传进化分析,利用RDP4软件进行PEDV S1基因的重组分析。结果表明:成功克隆出pMD18-T-PEDV-S1,将该毒株命名为HB/HS/2019株,其包含N末端域和C末端域的S1基因近全长序列,长度为2 163 bp,编码721个氨基酸;成功预测S1潜在的B细胞表位和T细胞基序。经同源性分析,HB/HS/2019与四川株CH/SCJY/2018 S1基因的相似性最高,为99.8%;与比利时CV777毒株的基因相似性为91.4%,存在插入和缺失现象。经进化分析,40株PEDV分为GⅠ群和GⅡ群,HB/HS/2019属于GⅡ群。在GⅡ群内,我国流行株均为2010年后出现,HB/HS/2019与市售疫苗株AJ1102和LW/L亲缘关系较近,与CV777和attenuated CV777株亲缘关系较远。经重组分析,未发现HB/HS/2019 S1序列含有潜在的重组事件,发现GⅠ群和GⅡ群的毒株之间S1基因存在3个重组事件。说明HB/HS/2019 S1基因与2010年以后我国报道的变异毒株亲缘关系较近,虽然该基因存在一些核酸位点变异,但是尚未发生基因重组事件。

黑龙江省2017年猪流行性腹泻病毒S1基因的遗传演化分析

为了监测黑龙江省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行及遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2017年采集到的黑龙江地区猪场腹泻样品进行了PEDV检测,并对PEDV阳性样品进行S1基因测序及遗传演化分析。结果表明:试验成功获得6条PEDV S1基因序列,6株毒株S1基因之间核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.8%~100%和96.7%~100%,与国内外近5年分离毒株S1基因核苷酸序列的同源性分别为89.9%~100%和90.7%~100%,与国内外近5年分离毒株S1基因氨基酸序列的同源性分别为88.3%~98.8%和88.0%~97.8%,与传统疫苗株CV777 S1基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.4%~91.0%和89.3%~90.4%。6株毒株均属于GⅡ型,与近年来广泛流行于我国养猪场并造成严重经济损失的毒株属于同一基因型,与传统疫苗株CV777分属于不同亚群。6株毒株的氨基酸变化主要发生在第一个抗原表位,即499~638位氨基酸上。说明黑龙江地区养猪场猪群中仍然存在PEDV的传播和感染,且与商品化的疫苗毒株相比基因变异明显。

沈阳地区1株猪流行性腹泻病毒S1基因序列测定与分析

利用PEDV的S1基因的特异性引物,克隆了沈阳地区1株PEDV流行毒株(LNSY-2017)的S1基因,并通过S1基因序列比对,分析了此病毒株与其他相关毒株的亲缘关系。结果显示:LNSY-2017株S1基因(2 372 bp)与我国疫苗株CV777(2 364 bp)相比,存在16个核苷酸的插入和8个核苷酸的缺失,导致推导的氨基酸序列存在6个氨基酸的插入(^(56)G、^(59)QGVN^(62)和^(69)G)和6个氨基酸的缺失(^(73)N、^(157)FA^(158)、^(380)YL^(381)和^(521)G),且在2个主要中和抗体表位(aa499～637和aa763～770)有11处氨基酸的突变。遗传进化分析结果显示,LNSY-2017与主要的疫苗株同源性较低(91.4%～92.5%),而与2012年韩国毒株、美国2013年毒株以及中国近年来流行毒株同源性最高(97.0%～98.7%),属于基因G2b型。结果表明,沈阳地区的PEDV流行株已经发生很大变异,因此很有必要加强对PEDV变异的监测。

2016年~2022年福建地区猪流行性腹泻病毒S基因的遗传变异分析

为了解2016年~2022年福建地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行现状及遗传变异情况,本研究对从福建地区采集的231份疑似猪流行性腹泻(PED)发病仔猪病料样品经RT-PCR进行PEDV的检测,选取不同地区22份PEDV阳性样品经PCR扩增S基因并测序,采用MegAlign分析PEDV S基因及其编码氨基酸序列的相似性,采用MEGA7.0软件构建其系统发育树,采用MegAlign分析S基因编码氨基酸序列的分子特征,分别利用RDP4、SimPlot、MEGA7.0软件进行S基因的重组分析,并利用BEAST软件进行该基因分歧时间估算。结果显示,福建地区PEDV总阳性率为51.51%(119/231),福建5个不同地区PEDV阳性率为40.00%~63.16%。从22份PEDV阳性样品中获得19条PEDV S基因序列,全长4149 bp~4161 bp,共编码1382 aa~1386 aa,19株PEDV S基因序列及其编码氨基酸序列之间相似性分别为94.4%~100%和93.8%~100%。19株PEDV S基因系统发育分析结果显示,其中18株PEDV属于GIIb亚型,1株属于GIb亚型。S蛋白氨基酸序列分析结果显示,与经典疫苗株CV777相比,18株GIIb亚型PEDV S蛋白的氨基酸序列在aa55~aa56、aa135~aa136和aa155~aa156处存在插入与缺失,具有典型的PEDV变异株的分子特征;其中14株还出现了独特的aa1193缺失。与GII型疫苗株AJ1102相比,19株PEDV S1区氨基酸突变率为60.00%~83.82%,其中18株GIIb亚型PEDV S1区氨基酸突变位点中有10个位于S蛋白重要结构域;基因重组分析结果显示,有3株PEDV S基因存在重组事件,其中FJLY01-2018株由GD-B株和CH-S株重组而来,FJLY02-2018株由CH/HNPJ/2017株和PEDV4-S-3株重组而来,FJLY03-2022株由PEDV-1931-1-Valladolid-Molpeceres株和HUA-M17株重组而来;S基因分歧时间估算结果显示,福建地区GIIa亚型、GIIb亚型、GIa亚型及GIb亚型PEDV的最早分歧时间约为1995年、2009年、2010年和2011年。上述结果表明福建地区PEDV流行率较高,田间流行株基因型具有多样性,且存在重组现象,临床上应予以高度重视。本研究为福建地区PED的流行病学调查及免疫防控提供了参考。

干扰素刺激基因ISG15对猪流行性腹泻病毒复制的作用及机制分析

【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染细胞不同时间点PEDV M基因mRNA和N蛋白表达量,并从RNA和蛋白水平检测ISG15表达变化;分别构建猪ISG15基因干扰和过表达细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验检测ISG15基因表达对PEDV复制水平的影响;对ISG15基因过表达前后进行转录组测序分析,筛选其下游调控基因及信号通路。【结果】ISG15基因在仔猪肠道组织中特异性高表达,其中空肠和回肠中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);PEDV感染组十二指肠、空肠及回肠中ISG15基因表达量显著或极显著高于健康组(P<0.05;P<0.01);M基因mRNA和N蛋白表达量出现上升趋势,与0 h相比,ISG15基因表达水平在24 h出现极显著上调(P<0.01);ISG15基因过表达后PEDV复制出现显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而ISG15基因干扰后PEDV复制出现极显著上调(P<0.01);转录组测序发现,过表达ISG15基因前后存在1 532个差异表达基因,且其主要富集在自噬、MAPK、内吞等信号通路中。【结论】本研究揭示了PEDV感染过程中ISG15基因的调控功能及作用机制,发现ISG15基因上调可显著抑制PEDV复制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

不同猪源受体菌表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1诱导免疫应答的比较研究

旨在比较猪源副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)作为口服疫苗载体,表达外源蛋白刺激仔猪产生免疫能力的强弱,以期选取合适乳酸菌作为受体菌载体。本研究首先体外鉴定表达PEDV S1蛋白的重组猪源副干酪乳酪杆菌(pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2)、猪源罗伊氏黏液乳杆菌(pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31)、猪源约氏乳酸杆菌(pPG-T7g10-S1/L.johnsonii 6332)的耐酸耐胆盐能力,考察3株重组菌的抗逆性。结果表明,3株重组菌均能够耐受酸和胆盐环境,且与其野生型菌株没有显著差异。接下来为比较3株重组菌的免疫效果,口服免疫初生仔猪后,利用间接ELISA和中和试验检测仔猪产生的特异性抗体水平及其中和活性;并测定免疫后仔猪血清和肠黏膜中各细胞因子水平。结果显示,口服免疫后,与对照组相比,3株免疫组仔猪血清IgG抗体和鼻拭子、肛拭子、肠黏液中SIgA抗体水平均显著升高,且可持续至第28天左右,其中pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组诱导产生的抗体水平显著高于其他两组免疫组(P<0.05);仔猪产生特异性的IgG和SIgA对PEDV均具有中和活性。仔猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平和对照组相比显著升高(P<0.05),但3株重组菌组间细胞因子水平未见明显差异;仔猪空肠黏膜中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、IL-21、TGF-β、APRIL和BALL水平与对照组相比有所升高,且pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组IL-4、IL-5、IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21和BALL相比其他组显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究分别将质粒组成型表达PEDV主要保护性抗原S1的重组猪源副干酪乳酪杆菌、猪源罗伊氏黏液乳杆菌和猪源约氏乳酸杆菌口服免疫仔猪,结果显示能够刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,且相较于其他2株重组菌,重组猪源副干酪乳酪杆菌pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2的口服免疫效果最好。该试验结果为构建更为有效的乳酸菌口服疫苗提供了科学数据。

PCIF1基因敲低细胞系的构建及其对猪流行性腹泻病毒复制影响的探究

【目的】旨在构建甲基转移酶——磷酸化C端结构域相互作用因子1(PCIF1)敲低细胞系,为探索PCIF1对猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制及其分子机制研究提供试验基础。【方法】利用RNA干扰(RNAi)技术构建PCIF1基因敲低(PCIF1-KD)细胞系。首先构建PCIF1基因特异性靶向干扰载体——pcDNA3.1-Double U6-mCherry-sh PCIF1,后经脂质体介导转染至非洲绿猴肾细胞(Vero-81),并通过遗传霉素筛选、富集PCIF1-KD重组细胞,以RT-qPCR和Western blotting检测PCIF1基因的敲低效果,并验证PEDV在获得的重组敲低细胞上的增殖能力。【结果】(1)重组干扰质粒经测序显示基因序列正确,证明成功构建PCIF1干扰质粒;(2)RT-qPCR和Western blotting试验结果表明,重组Vero-81细胞中PCIF1被显著敲低,获得了稳定的PCIF1-KD重组细胞系sh-△PCIF1-Vero-81;(3)PEDV感染验证发现PEDV在sh-△PCIF1-Vero-81细胞的增殖水平被显著抑制,且在感染后24~36 h病毒mRNA表达水平和蛋白表达水平均被进一步抑制。【结论】利用RNAi技术成功构建了一株稳定敲低PCIF1基因的细胞系sh-△PCIF1-Vero-81,PCIF1基因的沉默对PEDV的复制具有显著的抑制作用,且抑制程度随着时间增加而增加。研究结果可为进一步探究PCIF1对PEDV的影响或相互作用的分子机制提供有力工具和参考。

猪流行性腹泻病毒变异毒株中和表位区S10原核表达及多克隆抗体的制备

试验对猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株S1的S10表位区进行表达,并制备抗S10蛋白多克隆抗体。将S10区基因连接至原核表达载体pET-32a(+),经大肠杆菌原核表达系统成功表达pET-32a-S10重组蛋白,重组蛋白分子量约为41 kDa,利用Ni柱进行亲和纯化后浓度为2.01mg·mL^(-1)。纯化的重组蛋白经Western blot鉴定后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并收集小鼠血清,利用间接ELISA方法检测血清中抗体效价可达到1∶12800,该抗体可以结合S10重组蛋白和天然PEDV HM2017毒株。研究成功制备了良好免疫原性的PEDV S10蛋白多克隆抗体,为进一步研究S1蛋白及PEDV诊断方法的建立奠定基础。

表达猪流行性腹泻病毒S1基因植物乳酸杆菌工程菌的免疫原性分析

为探究表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1基因的植物乳杆菌工程菌是否对动物产生保护力,利用构建的含重组质粒pVE5523-S1乳杆菌口服免疫豚鼠3次,每次间隔14 d,每次2×10^(8) CFU/只。并以植物乳杆菌及含表达质粒pVE5523植物乳杆菌为阴性对照,进行相同处理。用猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联活疫苗(HB08株+ZJ08株)肌肉注射接种豚鼠,免疫3次,每次间隔14 d,每次0.2 mL/只,作为阳性对照。分别在免疫后的0 d、7 d、14 d、24 d、31 d、41 d及48 d对4组试验豚鼠心脏采血并分离血清,进行酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体和中和试验分析,同时无菌采豚鼠脾脏,进行脾细胞增殖实验分析。结果显示,工程菌能刺激机体产生分泌性抗体sIgA、特异性中和抗体,还可刺激机体IL-4和IFN-γ的增长以及脾细胞的增殖。说明该PEDVS1基因植物乳杆菌工程菌使豚鼠对PEDV产生了特异性免疫力,为后续口服疫苗的研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达

PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。

2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV-S基因型分析

2010年以来,全国大部分地区暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在浙江省的流行和遗传变异情况,对2010—2013年收集的临床腹泻样品,以针对PEDV-S基因N端序列的RT-PCR检测病原,并测序其中的41份样品的扩增序列,分析PEDV-S1基因型变异情况。临床检测结果表明:PEDV临床检出率由2010年的42.86%提高到2013年的70%以上,并且浙江省各地的检出率都在50%以上;一年中7至8月份检出率明显降低。PEDV-S1基因N端序列分析结果表明,临床检测株的S1基因与传统毒株PEDV CV777的S基因序列及中国最早检测到的基因序列亲缘关系较远,可能浙江省PEDV的流行株可能属于一个新的基因型。同时研究结果提示PEDV-S基因的变异可能是现有CV777毒株疫苗免疫保护力不佳的原因。