枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌混合饲喂对仔猪肠绒毛发育的影响

本研究主要探讨混合饲喂枯草芽孢杆菌RJGP16和猪源乳酸杆菌B1对仔猪肠道肠绒毛发育的影响,以及这两种益生菌在体内拮抗大肠埃希氏菌K88的能力。试验选取8窝新生仔猪为研究对象,分别于0、7、11和26日龄经口腔灌服枯草芽孢杆菌菌液(活菌数1.0×109 CFU·mL-1)、猪源乳酸杆菌菌液(活菌数1.0×109 CFU·mL-1)、枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌混合菌液(体积比1∶1),以及对饲喂混合菌液的试验组进行大肠埃希菌K88的攻毒试验。试验结果表明,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌能显著提高十二指肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)的肠绒毛高度,增加十二指肠(P<0.05)和空肠(P<0.01)绒毛的数量,降低空肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)的隐窝深度,以及增加十二指肠(P<0.05)、空肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)的绒腺比。此外,同时饲喂这两种益生菌能有效地拮抗大肠埃希菌K88对仔猪肠道上皮的损伤。笔者的研究提示枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对肠道绒毛的发育起到了促进作用,并能有效地提高抗感染能力。

猪源乳酸杆菌的分离鉴定及体外抑菌试验

为了获得用于研制微生态制剂的乳酸杆菌菌株,从健康仔猪小肠中利用MRS固体培养基分离得到一株革兰氏阳性杆菌,通过培养特性、染色特征、菌落形态以及生化鉴定结果,初步判定该菌株为乳酸杆菌,再结合16S rDNA分子鉴定进一步确定该菌株为乳酸杆菌。牛津杯法体外抑菌试验结果显示,该菌对致病性大肠杆菌的抑菌效果较好,可以作为微生态制剂的保存菌种。

猪源乳酸杆菌的分离鉴定及其发酵培养条件优化

微生态制剂是发展绿色养猪业的关键,乳酸杆菌是目前应用的微生态制剂中最重要的有益菌组成成分之一。分离、鉴定并筛选出1株耐酸和耐胆盐能力较强的乳酸杆菌,命名为乳酸杆菌L5株。采用单因素法和正交试验设计法对其发酵培养条件进行了优化,发酵培养菌落总数可达8.25×108 cfu/mL。

猪源乳酸杆菌对永生化猪小肠上皮细胞的黏附性能

以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02为体外模型,通过革兰染色法、平板计数法等检测发酵乳杆菌Y091231(Lactobacillus fermentation)、乳酸乳杆菌Y091221(Lactobacillus lactis),嗜酸乳杆菌Y224031(Lactoba-cillus acidophilus)的黏附性能及对大肠杆菌C83921、致病性沙门菌、金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑制作用。结果显示,3株菌对永生化猪小肠上皮细胞的黏附性均较强,黏附指数平均为:Y091231(2 903.25±83.33)个/100cells、Y091221(2 320.37±81.02)个/100cells、Y224031(1 965.43±37.72)个/100cells,菌株之间差异不显著(P>0.05)。黏附抑制试验结果显示,Y091231对大肠埃希菌C83921和金黄色葡萄球菌CVCC 2258的黏附抑菌能力最强((99.4±3.17)%和(98.0±2.31)%),Y091221对沙门菌的抑菌能力最强((97.1±2.04)%),Y224031对大肠埃希菌C83921比对另外2种致病菌的黏附抑制能力高,但又显著低于Y091231和Y09 1221(P<0.05),表明不同种乳酸菌对致病菌的黏附抑制作用具有菌种特异性。

猪源罗伊氏乳酸杆菌对断奶仔猪生长性能和血清指标的影响

本研究旨在探讨在饲粮中添加猪源罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)对断奶仔猪生长性能和血清指标的影响。选用平均体重为(16.57±0.23)kg的断奶仔猪(杜洛克×长白×大白三元杂交)64头,随机分成4组,每组4个重复,每个重复4头。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲粮分别在基础饲粮中添加0.25%、0.50%、0.75%的猪源罗伊氏乳酸杆菌,试验期为30 d。结果表明:1)添加0.50%和0.75%猪源罗伊氏乳酸杆菌组断奶仔猪平均日增重分别比对照组提高了7.56%(P<0.05)和20.07%(P<0.05),料重比分别比对照组降低了1.96%(P>0.05)和14.90%(P<0.05);2)饲粮中添加猪源罗伊氏乳酸杆菌能够极显著降低断奶仔猪血清中白蛋白与球蛋白比值(P<0.01),并极显著增加血清中干扰素γ含量(P<0.01);3)添加0.50%和0.75%猪源罗伊氏乳酸杆菌组断奶仔猪血清中结合珠蛋白含量分别比对照组降低了8.79%(P<0.05)和9.34%(P<0.05)。结果提示,饲粮中添加猪源罗伊氏乳酸杆菌能够提高断奶仔猪机体免疫能力,而当其达到一定添加剂量时,对于提高断奶仔猪生长性能的效果表现明显。

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用。试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA/LR-CO21、含有空载体质粒的重组猪源罗伊氏乳杆菌pPG/LR-CO21和磷酸盐缓冲液(PBS)各4 mL,连续口服3 d,口服后观测时间为14 d。期间仔猪自由采食,记录各组仔猪体重变化和腹泻情况。试验2:选取30头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为5组,分别口服1、3、6、9、12 mL半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-7.50/mL的TGEV。设置7 d时间为观察期,分析半数致死量的条件。试验3:另选取1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪32头,随机分为4组,分别为重组菌组、空载菌组、对照组、TGEV感染组,每组8个重复,每个重复1头仔猪。试验组每天每头按照2×1010 CFU的剂量口服pPG-LFCA/LR-CO21、pPG/LR-CO21及等体积的PBS,连续口服饲喂1周,在8日龄按照半数致死量口服TGEV感染,感染7 d后进行样品采集。记录各组仔猪体重变化和腹泻情况;苏木精-伊红(HE)染色检测小肠绒毛高度及隐窝深度;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测仔猪血清中总免疫球蛋白G(IgG)和肠黏液总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)抗体含量;实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白相关基因封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Toll样受体2(TLR2)的mRNA相对表达量;对仔猪盲肠内容物进行菌群结构分析。结果表明:口服重组猪源罗伊氏乳酸杆菌后,与对照组相比,重组菌组新生仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01),而腹泻率降低且差异极显著(P<0.01);与TGEV感染组相比,重组菌组仔猪平均日增重增加且腹泻率降低,差异显著(P<0.05);空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的比值显著增加(P<0.05);仔猪血清中总IgG和肠黏液总sIgA抗体含量显著升高(P<0.05);肠黏膜组织中紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),血清中细胞因子TNF-α含量极显著降低(P<0.01),血清IFN-γ、IL-6、IL-8、TLR2含量极显著升高(P<0.01),仔猪存活率提高。对仔猪盲肠内容物进行菌群多样性分析结果显示,TGEV感染仔猪后肠道正常菌群占比下降,相比于TGEV感染组,口服重组菌的仔猪肠道菌群致病菌拟杆菌属占比下降,差异显著(P<0.05),菌群多样性更接近对照组,肠道菌群的代谢、遗传信息处理等功能均有所增强。综上所述,本试验成功构建了分泌表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌菌株,经口服途径饲喂新生仔猪后,能够促进仔猪生长,降低新生仔猪的腹泻率,经口服途径饲喂感染TGEV的新生仔猪后,可以改善肠道环境,降低病毒对仔猪肠道的损伤,对仔猪抗TGEV感染提供有效保护。

猪表皮生长因子在植物乳杆菌中的表达及其活性检测

为获得一株高效表达猪表皮生长因子(p EGF)的重组植物乳杆菌,并检测其生物活性,从仔猪肠道内容物中分离植物乳杆菌,选择其中生物活性最强的一株(Lp-1)为宿主。以商品化乳杆菌表达载体p IAβ8为骨架,干酪乳杆菌超强组成型启动子SCP、M6前体蛋白信号肽SP、猪表皮生长因子p EGF等为元件,构建表达p EGF的植物乳杆菌重组表达载体p SCPSE。用电转化方法 (2.0 k V,2 000?,25μF,4.0 ms)将重组载体p SCPSE转化入宿主菌Lp-1中获得重组植物乳杆菌Lp-p SCPSE。以Tricine-SDS-PAGE法和p EGF ELISA特异性检测试剂盒检测目的蛋白的表达;用培养12 h的阳性转化子菌体给刚断奶的BALB/c小鼠灌胃,2次/d,连续10 d,以断奶小鼠的体重、肠绒毛长度和隐窝深度的变化为指标,检测目的蛋白的生物活性。Tricine-SDS-PAGE检测和小鼠实验结果显示,重组植物乳杆菌的培养上清中出现6 k Da左右p EGF的特异性条带,且表达p EGF的重组植物乳杆菌能显著增加(P<0.05)断奶小鼠的体重、肠绒毛高度和肠隐窝深度。结果表明,p EGF在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物学活性。