猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b(+)的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

猪源出血性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

为了确定导致豫西地区某养殖户饲养的生猪发病而死亡的原因。本试验通过采集病死猪的肺脏、肾脏、肠道等组织,经过细菌的分离培养,形态观察,生化鉴定,16S rDNA扩增并测序、同源性比对方法,确定分离菌株为大肠杆菌,且与已报道的大肠杆菌(ATCC 11775)同源性达到99.36%。通过大肠杆菌的s tx 2毒力基因引物进行了PCR扩增、测序分析及小鼠攻毒试验,最终确定引起该养殖户生猪发病的病因为出血性大肠杆菌,且致病性较强。通过选择临床常用的10种抗菌药物对分离菌进行药敏试验,发现该菌对不同药物呈现出不同的敏感性,其中对硫酸黏菌素、阿米卡星、恩诺沙星表现高度敏感,对头孢噻呋表现中度敏感。本试验结果可为临床兽医工作者在诊断和治疗由出血性大肠杆菌引起的生猪发病而死亡病例时提供有益的参考。

黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内保护作用

为探究黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)感染小鼠后的保护作用,采用小鼠存活率试验和组织载菌量试验评估黄芩苷对小鼠的保护作用,比较感染组和黄芩苷治疗组小鼠临床表现、存活率、组织载菌量及病理变化。结果表明,猪源肠外致病性大肠杆菌感染后小鼠状态萎靡不振、食欲下降,黄芩苷治疗组小鼠状态较感染组状态好;黄芩苷治疗组小鼠存活率相对于感染组有一定提升;黄芩苷治疗组小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏中组织载菌量及病理变化相对于感染组均极显著降低(P<0.01)。

我国部分地区猪源大肠杆菌LEE和HPI毒力岛相关基因的检测

目的采用PCR方法检测我国江苏等9个省市部分地区分离的1 007株猪源大肠杆菌中肠细胞脱落位点毒力岛(LEE)和强毒力岛(HPI)。方法对LEE毒力岛检测其核心区的ler和eaeA基因,对HPI毒力岛检测其irp2和fyuA基因。同时对LEE和/或HPI阳性大肠杆菌进行了O血清型的鉴定。结果在分离的猪源大肠杆菌中,LEE毒力岛基因检测结果为:2.2%(22/1 007)的菌株ler和eaeA基因的扩增阳性,0.5%(5/100 7)的菌株eaeA阳性。HPI毒力岛基因检测结果为:10.6%(107/1 007)的菌株irp2和fruA基因扩增阳性,2.1%(21/1007)的菌株irp2阳性;其中有2株irp2和ler基因扩增阳性,有3株irp2、ler和eaeA基因扩增阳性,1株irp2f、yuA、ler和eaeA基因扩增都为阳性;在128个HPI阳性分离株中,O93和O107血清型菌株分别占定型菌株的15.7%(13/83)和12.0%(10/83)。结论2.7%的猪源大肠杆菌携带LEE,12.7%的菌株携带耶尔森菌HPI,O93和O107为猪源HPI大肠杆菌常见血清型。

猪源肠外致病性大肠杆菌致脑膜炎机制的研究进展

细菌脑膜炎是由肠外致病性大肠杆菌引起的神经炎症所导致,在全世界范围有较高的发病率和死亡率。随着细菌耐药性增强,以抗生素为主的治疗手段逐渐面临挑战。以临床分离猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033菌株感染为切入点,深入探讨了该病的致病机制,从病原、宿主及致病机制等方面寻找已经发现的毒力因子和靶标蛋白,积极探索非抗生素疗法,寻找新药物靶点等方法以应对细菌性脑膜炎暴发。

54株猪源肠外致病性大肠杆菌血清型、系统进化群和基因型

摘 要:[背景]近年来,我国规模猪场着重加强了对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪瘟、猪伪狂犬病、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病等疫病的防控,却忽视了由肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)对猪群健康产生的潜在危害性,了解和掌握猪源ExPEC流行特征意义显著。[目的]探究临床分离的54株猪源ExPEC血清型、系统进化群和基因型的分布及流行特征。[方法]应用玻板凝集试验和试管凝集试验鉴定O抗原血清型,采用PCR技术检测系统进化群鉴定相关基因、28个ExPEC相关毒力基因以及多位点序列分型相关基因。[结果]受试菌中有52株确定了O抗原血清型,其中40株为O38 (74.1%),为优势血清型;8株为O127 (14.8%),O93和O11均2株(各占3.7%)。受试菌中44株为B2群(81.5%),是主要系统进化群,D群和B1群均5 株(各占 9.3%);28 个 ExPEC 相关毒力基因中ompA、ibeA、fimH、traT、focD、papA、iroN、iutA、iucD、cvaC、tsh、kpsMT Ⅱ、iss和ompT出现的频率超过50%,其中ompA和ibeA检出率分别达100%和96.3%,为高度流行的毒力基因,未检到cnf1,而bmaE、malX和iha更倾向分布于D群菌株中。受试菌共呈现31种ST型,其中ST10和ST648均5株(各占9.3%),ST410和ST101均4株(各占7.4%)。[结论]猪源ExPEC优势血清型及系统进化群在不同地区、不同时段上的流行分布均存在一定差异,呈现动态过程,O38作为优势血清型目前尚未见报道,具有高致病性的B2群和D群菌株有逐渐增多的趋势。ST型复杂多样,呈现遗传多样性,在一定程度上与人源和禽源ExPEC具有相同的遗传背景。

西藏牦牛源EHEC的MLST聚类和致病性分析

目的掌握西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌核酸多位点序列分型、聚类情况和致病性。方法对实验室已分离鉴定的14株肠出血性大肠杆菌采用分子生物学和动物实验的方法,进行多位点序列分型鉴定及聚类分析,动物实验后挑选致病性最强菌株进行生长曲线测定和半数致死量(LD 50)计算,HE染色制作组织病理切片。结果14株牦牛源肠出血性大肠杆菌中共出现了3种ST型,分别为ST 33、ST 226、ST 446,各ST型中西藏阿里菌株占比最多为57%(8/14);各ST型中ST 33占比最多为57%(8/14),其次是ST 226占比14%(2/14)该型菌株的致病性最强,ST 446占比最少为7%(1/14)。此外,还有3株占比22%(3/14)未定型肠出血性大肠杆菌。MLST聚类分析表明管家基因在不同ST型中携带等位基因的数量不同,ST 33型中Mdh 22个最多,ST 446型中icd 26个最多,ST 226型中Fumc 27个最多。14株菌株攻毒80只小鼠表现出不同程度的致病性,其中ST 226型致病性最强。将致死小鼠解剖后发现肠上皮出血水肿,脾脏、肝脏有淤血等病理变化。14株菌株中的阿里株(TBY 7)是ST 226型其致病性最强,其生长曲线显示14 h达最大生长数,浓度为1×10^(11)cfu/mL;60只小鼠差浓度梯度攻毒试验计算出该菌的LD_(50)为2.4×10^(7)cfu/mL。阿里株(TBY 7)ST 226型感染小鼠后经HE染色制作组织病理切片后,结果显示小鼠的十二指肠、盲肠、结肠和直肠黏膜上皮坏死脱落,盲肠肠壁内可见寄生虫,空肠、回肠绒毛结构坏死萎缩、固有层充血;肝细胞轻微空泡变性,脾脏红髓轻微淤血。结论西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌存在不同ST型,且各地区均有分布;不同ST型的致病性与携带等位基因数量相关,且主要引起肠组织病变,提示相关部门应加强对该致病菌的宣传。

O_(157)∶H_7——又一个警钟

继去年非洲流行埃博拉出血热,今年欧洲疯牛病事件之后,5月下旬以来亚洲岛国日本暴发的O157∶H7

江苏省疾病预防控制中心急性传染病防制科工作介绍

江苏省疾病预防控制中心急性传染病预制科负责全省急性传染病的监测和预防控制工作。通过开展疾监测、疫情管理工作，组织和参与突发疫情调查处理，将霍乱、肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻、肝炎、伤寒等肠道传染病等作为防制重点，兼顾出血热、狂犬病等作为防制重点，兼顾出血热、狂犬病及流感等自然疫源性传染病和呼吸道传染病防制工作，