猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D600nm值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸+0.3mol/L蔗糖,电场强度为11kV/cm,脉冲时间为3.8ms,电击后细胞复苏3～4h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。

猪A组轮状病毒pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的构建及表达

以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析。结果表明,在MRS培养基中加入1%甘氨酸+0.3mol/L蔗糖,电场强度为11kV/cm,脉冲时间为3.8ms,电击后细胞复苏3～4h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株 JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1 756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得 vp4 基因的表达,对表达的 VP4 蛋白进行 Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株 CRW 8 株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明 JL94株与 CRW 8 株属同一 VP4 血清型,而与 Gottfried株属不同血清型。JL94 株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于 aa81 aa207。vp4 基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的 20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断 JL94 在 MA104 细胞上引起的细胞病变。

猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计—对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析。结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98％和98.05％,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型。本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。

猪轮状病毒JL94株vp4全基因克隆及原核表达载体构建

根据GenBank已发表的猪轮状病毒vp4基因保守序列,设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株vp4全基因;将扩增产物与载体pMD-18T连接进行序列测定并将测序结果同国外分离株进行序列比较。用限制性内切酶BamHI和SalI将vp4基因从pMD-18T-vp4切下;同样用BamHI和SalI双酶切表达载体pGEX-6P-1;将这2个双酶切产物连接并转化,通过酶切鉴定和PCR鉴定证明完成了vp4原核表达载体的构建。测序结果表明:vp4全基因长2362bp,JL94株同国外分离株BEN307株、Gottfried株vp4全基因片段核苷酸同源性分别为93.44%和69.43%;氨基酸同源性分别为96.06%和71.88%。说明JL94株同BEN-307株属同一VP4血清型,而同Gottfried株属于不同血清型。重组原核表达载体pGEX-6P1-vp4的构建为表达VP4蛋白,研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。

2022年江苏省4种猪腹泻病毒分子流行病学调查

为了解江苏省猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的遗传变异趋势,采集了2022年江苏省不同猪场的病猪腹泻病料36份,使用RT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV感染情况,并对部分检测结果为阳性的PEDV、TGEV、PDCoV进行S基因扩增、测序和分析,对PoRV进行VP4、VP7基因扩增、测序和分析,共获得8个PESV S基因,1个TGEV S基因,1个PDCoV S基因,9个PoRV VP4及VP7基因序列。基于PEDV S基因的序列分析结果表明,2022年江苏PEDV流行毒株与我国2010年以来流行的GⅡ-b亚群变异株的序列同源性为97.0%~99.7%,属于同一亚群,而与CV777、SD-M等早期毒株亲缘关系较远;江苏PEDV流行毒株S1蛋白区域存在氨基酸的突变、插入及缺失,不同流行毒株之间存在一定的差异。基于TGEV S基因的序列分析结果表明,江苏TGEV流行毒株与中国毒株WH-1同源性最高,为99.9%;其S基因仅发生了3个氨基酸突变。基于PDCoV S基因的序列分析结果表明,江苏PDCoV流行毒株与CHN/HG/2017株的同源性最高,为98.2%,与来自中国、越南、老挝、泰国等东南亚国家的毒株亲缘关系较近,属于同一群;江苏PDCoV流行毒株的S1蛋白区域发生6个氨基酸的突变。基于PoRV VP4及VP7基因的序列分析结果表明,江苏PoRV流行毒株属于A群轮状病毒,具有G3[P13]型、G3[P23]型、G4[P13]型、G4[P23]型、G9[P13]型、G9[P23]和G11[P13]型7个不同的基因组合型。本研究结果为掌握江苏地区PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV的流行情况、遗传进化趋势及其防控提供了理论依据。

2021-2022年我国部分地区猪轮状病毒分子流行病学调查

为了解我国部分地区猪场猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)的流行情况及分子特征,对2021-2022年我国部分省份的86个规模化猪场的6 472份腹泻样品进行检测,用RT-PCR方法调查PoRV的流行率,并对PoRV阳性样本进行VP7和VP4基因扩增、测序,使用MegAlign软件进行同源性分析,利用MEGA11.0构建系统进化树。结果显示,PoRV的样品阳性率为27.89%(1 805/6 472),猪场阳性率为65.12%(56/86);从98份阳性PoRV样本中扩增出76个VP7片段,G9为优势基因型(42.11%),基因型G5、G26、G3、G4、G1、G2和G11各占26.32%、9.21%、6.58%、6.58%、3.95%、2.63%和2.63%。扩增出的35个VP4基因片段,以P[13]型为主,占57.14%;其次为P[7]、P[23]、P[3]和P[6]型,分别占20%、14.29%、5.71%和2.86%。35个毒株成功鉴定出G/P基因型,G9P[13](28.57%)为优势组合基因型,其他基因型为G5P[13](11.43%)、G4P[13](8.57%)、G9P[23](8.57%)、 G26P[13](5.71%)、G1P[7](5.71%)、G26P[3](5.71%)、G5P[7](5.71%)、G3P[7](2.86%)、G11P[23](2.86%)、G5P[23](2.86%)、G11P[7](2.86%)、G3P[13](2.86%)、G5P[6](2.86%)和G4P[7](2.86%),其中G11P[7]为国内首次鉴定到的基因型。综上,目前PoRV的流行率高且基因型复杂,优势组合基因型为G9P[13]。该结果丰富了PoRV的分子流行病学资料,对我国猪PoRV感染的防控具有重要意义,也为新型疫苗研发提供了参考依据。

猪轮状病毒JL94中国分离株衣壳蛋白基因的分析

根据GenBank发表的猪轮状病毒衣壳蛋白vp4基因、vp6基因和vp7基因保守序列,设计合成3对引物,分别扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株的此3段基因并进行序列分析。结果表明,JL94株vp4基因与国外分离株CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP4氨基酸同源性分别为97.16％、95％、71.88％、73.45％和70.88％;JL94株vp6与CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP6氨基酸同源性分别为96.98％、97.48％、93.20％、97.48％和93％;JL94株vp7基因与CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP7氨基酸同源性分别为98％、99.90％、75.40％、84.66％和80％。可见JL94株同CRW-8株、OSU株同源性更高些;vp4和vp7基因在同型间高度保守而不同型间差距较大,vp6基因在同群和非同群间差别不是很明显。同时可以判定JL94属于A群Ⅰ亚群G5P7血清型PRV。研究猪轮状病毒中国分离株JL94株衣壳蛋白基因的特征,为研制高效抗病毒疫苗奠定基础。

2022—2023年我国部分地区猪A群轮状病毒分子流行病学调查分析

【目的】探究我国部分地区猪A群轮状病毒(RVA)的分子流行病学特征,明确当前的优势基因型,为RVA科学防控与疫苗研发提供理论依据。【方法】2022年1月—2023年3月收集江苏、江西、福建、山西和贵州5省36个规模化猪场送检的434份腹泻仔猪粪便样品,采用RT-PCR检测样品RVA阳性情况,对部分RVA阳性样品的VP7和VP4基因进行扩增及测序,与各型参考序列进行多序列比对,使用MegAlign进行核苷酸序列同源比对分析,并采用MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树。【结果】RT-PCR检测结果显示,434份腹泻仔猪粪便样品中RVA阳性样品为196份,阳性检出率为45.16%。2022年与2023年初的阳性检出率分别为40.37%(132/327)和59.81%(64/107)。根据样品来源地区,RVA阳性检出率最高的是江苏(57.70%),其次是江西(55.71%),福建、贵州和山西的RVA阳性检出率分别是35.66%、30.00%和22.23%。共获得各地区12株RVA的VP4和VP7基因序列信息,遗传进化分析结果表明,G型中G9为优势基因型(占83.4%),G4和G5分别占8.3%;而P型中P7为优势基因型(占75.0%),其次为P13和P23,分别占16.7%和8.3%;12株RVA分属4种基因型组合,分别为G9P[7](占75.0%)、G5P[13](占8.3%)、G9P[13](占8.3%)和G4P[23](占8.3%)。【结论】我国部分省份猪场RVA阳性检出率持续升高,猪群中RVA基因型复杂多样,优势基因型组合为G9P[7]。因此,今后有必要对猪群中RVA的流行情况进行持续监测,结合基因型致病性制定预防措施并开发针对性疫苗。

从中国分离的G9P[23]猪轮状病毒的分子特性

G9轮状病毒是公认的在全世界传播的基因型。G9型A组轮状病毒——G9P[23]株是非常罕见的，本研究对其进行了序列分析，将其命名为轮状病毒Apig／China／NMTL／2008／G9P[23]，简写为NMTL，它是从中国的腹泻仔猪中分离出来的。核苷酸序列分析显示VP7基因汇聚在G9谱系VId，VP4基因汇聚在罕见的P[23]基因型。

泰国首次分离出G10猪轮状病毒

最近,泰国和日本科研人员合作,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查了从泰国腹泻仔猪采集的557份粪样中的轮状病毒RNA。结果分别有23份、1份和2份粪样为A群、B群和C群轮状病毒阳性。用ELISA和PCR进行血清分型,分别在3份和14份粪样中发现病毒为血清型G3和血清型G10。有1份含有血清型G10病毒(P343株)的粪样,用MA104细胞分离出病毒。

转移猪轮状病毒VP4基因玉米植株的获得

根据GenBank中猪轮状病毒VP4基因序列设计引物,从重组克隆载体pMD18-T-VP4中PCR扩增VP4基因,将其插入到植物表达载体pCAMBIA3301中CaMV35S启动子下游,构建成高效植物表达载体pCAMBIA3301-VP4;然后利用农杆菌介导法,以玉米自交系H99茎尖来源的玉米愈伤组织为材料,将pCAMBIA3301-VP4导入其中,分化诱导获得再生苗后,对其进行PCR、Southern杂交和RT-PCR检测。结果表明,外源目的基因VP4已成功地转入玉米基因组中,并且目的基因能在转基因玉米植株中获得转录。

2009～2010年北京儿童腹泻中轮状病毒新VP4基因亚型的研究

P[8]b基因亚型是国内外新近发现的A组人轮状病毒(HRV)VP4基因的一种新亚型,本研究旨在建立有效鉴别HRV P[8]a和P[8]b基因亚型及P[4]和P[6]基因型的VP4基因打点杂交分型方法,并运用此方法对2009～2010年首都儿科研究所附属儿童医院门诊及住院腹泻患儿中P[8]b基因亚型HRV的流行情况及其G/P基因组合情况进行研究。通过对GenBank序列数据库可检索到的国内外HRV各种P基因型及亚型的VP4基因序列应用相关软件进行基因分析,在不同基因型别间核苷酸变异密集而相同P基因型内核苷酸高度保守的的位置设计各型别探针,并分别以本实验室上传GenBank的北京HRV地方株P[4]和P[6]基因型及P[8]a和P[8]b亚型的VP4基因作为相应型别探针的合成引物的设计模板及探针经PCR合成的合成模板,合成地高辛素标记的DNA探针。经测序验证所建立的VP4基因杂交分型方法结果可靠。对门诊88例(55%,88/160)及住院79例(70.5%,79/112)HRV腹泻患儿的P分型结果显示P[8]a亚型仍为主要型别,前者为96.6%(85/88),而后者为62.0%(49/79);P[8]b亚型在住院HRV感染腹泻患儿中占较高比例(27.9%,22/79),虽然其在门诊HRV感染患儿中也存在,但仅占2.3%(2/88);另外单纯P[4]基因型HRV感染仅在住院腹泻患儿中检测到1例(1.3%,1/79),而P[6]基因型在门诊及住院HRV感染腹泻患儿中均未检测到;本组标本中HRV P[8]b亚型主要与G9基因型组合。本研究表明G9P[8]b型HRV在北京腹泻儿童中有流行。

贵州省2017年~2023年PEDV和Po RVA流行病学调查及Po RVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(Po RVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-q PCR检测,并对Po RVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、Po RVA和PEDV+Po RVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株Po RVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份Po RVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分Po RVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测Po RVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型Po RVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型Po RVA VP7存在3处(I~(208)T、K~(212)A/V/T、V~(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型Po RVA VP7存在17处(S~(28)R/K、A~(29)I/T/M/V、L~(40)I/V、V~(44)L、S~(71)T、Q~(73)G/N/S/E、S~(90)A/Q/K/R、G~(94)N/S/A/K、N~(100)D/E、T~(122)A/S、T~(147)A/G/N/D、Q~(189)S/T、I~(208)L/Q/T、K~(212)T/I/P/N、A~(213)N/T/D、E~(267)D/N、V~(271)I)变异;3株P[6]型Po RVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型Po RVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型Po RVA VP4存在26处(I~(92)V、Q~(94)E、Q~(113)T/P/N、T~(114)N/Q/S/R、T~(115)Q/E、N~(116)S/L/T、P~(148)A/Q/V/S/I、T~(180)E/N/D、P~(162)T、I~(174)V/L、C~(269)Y、R~(281)N、A~(286)L/S、T~(302)N、A~(340)S/V、T~(379)S、T~(403)A、S~(438)P、R~(553)K、A~(569)A、M~(570)L、A~(608)S、E~(660)D、I~(726)F、K~(733)N、S~(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和Po RVA感染率高且基因型复杂,其中Po RVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。