猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株糖蛋白基因的遗传变异分析

新近发现的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 (PRRSV)是单股RNA病毒 ,属于不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较国内分离的CH la株与国外毒株的分子遗传学关系 ,扩增并克隆了PRRSVCH la株糖蛋白基因ORF2～ 5 ,测定了其核苷酸序列。用序列分析软件分析了其编码产物的分子量、等电点、疏水性、抗原性和有关位点 ,并与国外毒株进行了序列比较和系统发育进化分析。结果表明 :CH la株与VR 2 332株尽管密切相关 ,但二者之间也有较大的变异 ,且ORF3和ORF4重叠区存在一个高变区。这提示CH la株和VR 2 332株可能是北美洲型中的两个不同亚型。

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株N基因的分子克隆、序列测定及其比较分析

根据已发表的ＰＲＲＳＶＩＡＦ－ｅｘｐ９１株的核酸序列，设计了一对特异性引物，用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了ＰＲＲＳＶＣＨ－ｌａ株的Ｎ基因，经补平和磷酸化后，克隆到ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点上。经电泳分析、酶切和ＰＣＲ鉴定证实后，进行序列测定。序列分析表明ＣＨ－ｌａ株与ＩＡＦ－ｅｘｐ９１株（美洲型）Ｎ基因核苷酸同一性为９３．２％，氨基酸同一性高达９６．７％，而与ＬＶ株（欧洲株）核苷酸同一性为６３％，氨基酸同一性仅为５９％。其推导氨基酸残基分子量为１３．３ｋＤａ。根据ＣＨ－ｌａ株Ｎ基因推导的氨基酸残基缺少欧洲型毒株ＬＶ特有的两个氨基酸片段，表明ＣＨ－１ａ株与ＩＡＦ－ｅｘｐ９１株同源性高于它与ＬＶ株的同源性，而且ＣＨ－１ａ株与鼠乳糖脱氢酶增高症病毒（ＬＤＶ）在进化关系上比ＬＶ株与ＬＤＶ更密切。ＣＨ－１ａ株Ｎ基因推导的氨基酸残基Ｎ－端１／２段约２６％是由Ａｒｇ、Ｌｙｓ和Ｈｉｓ这３种氨基酸组成的，其疏水性侧像图与ＬＶ株和ＶＲ－２３３２株（美洲型）几乎相同，这表明两种基因型的核衣壳蛋白（Ｎ蛋白）具有一定的保守性。由于Ｎ蛋白是ＰＲＲＳＶ所有结构蛋白中免疫原性比较强的病毒蛋白，是现行血清学试验的抗原基础，因此Ｎ基因的分子克隆为研制ＰＲＲ?

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)分离鉴定及其与欧、美PRRSV抗原的比较

在我国吉林省某地猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）抗体阳性猪群的４头２日龄弱仔猪实质脏器中分离到２株ＰＲＲＳＶ。间接荧光抗体试验（ＩＦＡ）结果表明，ＰＲＲＳＶ（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）抗血清与２个分离株呈阳性反应；分离到病毒的弱仔猪血清与参考株（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）也呈阳性反应；而分离株与ＨＣＶ、ＰｒＶ、ＰＰＶ、ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ和ＨＥＶ无交叉抗原。以上试验证明，我们已成功地分离到２株地方性ＰＲＲＳＶ。进一步用六种ＰＲＲＳＶ单抗（Ａ～Ｆ）进行ＩＦＡ试验，结果２个分离株与ＶＲ－２３３２的荧光反应谱相同。说明它们之间在抗原结构上具有同源性。

猪生殖—呼吸道综合征病毒(PRRSV)E蛋白基因真核表达质粒的构建

新近发现的ＰＲＲＳＶ是单股ＲＮＡ病毒，属于不久前成立的动脉炎病毒科。其基因组包括８个开放阅读框架（ＯＲＦ），其中ＯＲＦ５编码糖基化的囊膜（Ｅ）蛋白，是病毒的主要免疫保护性抗原之一。为了研制ＰＲＲＳ基因疫苗，扩增并克隆了ＰＲＲＳＶ－１ａ株ＯＲＦ５，并将其亚克隆至真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ的ＣＭＶ启动子下游，构建成真核表达质粒。

全球猪生殖与呼吸综合征(PRRS)概况

引言二十世纪九十年代爆发的猪生殖与呼吸综合症（ＰＲＲＳ）大流行影响了世界上大多数养猪国家。尽管国内和国际上都出台了法规，控制对这种病的报告和运输、隔离、屠宰已感染猪，但该病毒仍继续扩散。一些国家对ＰＲＲＳ采取了常规血清学检查，以提交诊断报告和／或血清...

猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)的防治

PRRS又称猪繁殖与呼吸综合症、猪蓝耳病、猪流行性流产-呼吸综合症,是近十年来新发现的一种病毒性传染病,给养猪业造成很大的经济损失.我国1995年发现本病,1996年确诊,以妊娠母猪的流产、早产、产死胎、弱胎、胎儿木乃伊化及仔猪和肥猪的呼吸道症状为主要特征,系具有高度接触传染性的传染病.

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒活疫苗的安全性和体液免疫研究

采用转瓶生产技术,在MARC-145细胞中增殖PRRSV克隆20株,经过条件的优化选择,得到TCID≥10-7.55/mL的高滴度PRRSV溶液,为生产疫苗打下基础;所生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全无致病性,能刺激猪产生特异性抗体应答,接种后第14天可检测出特异性中和抗体。疫苗内的PRRSV滴度在冻干前后变化不大,冻干疫苗在4-8℃保存有效期为6个月,-20℃保存有效期达18个月,表明生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全且能刺激猪产生体液免疫应答,可用于PRRS的预防接种。

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。

猪生殖-呼吸道综合征国内分离毒株的病毒纯化及其结构蛋白分析

本研究主要对猪生殖呼吸道综合征（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ） 国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 进行了病毒纯化及其结构蛋白的分析。选用聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ６０００） 沉淀和差速离心法粗提了经 Ｍａｒｃ１４５ 细胞系增殖的猪生殖呼吸道综合征病毒（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 。并采用非线性蔗糖密度梯度离心法纯化了 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ， 经免疫电镜观察纯化病毒， 发现有较多的胶体金颗粒吸附在直径为４２ ～７８ｎｍ 的病毒粒子周围。经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定纯化病毒的滴度可达１ １６００ 以上， 并利用 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 两种方法对国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 与欧洲型（ Ｌｅｌｙｓｔａｄ） 、美洲型（ Ｖ Ｒ２３３２） 等参考毒株的病毒结构蛋白组成和部分抗原特性进行了初步的研究。测得国内分离毒株主要结构蛋白的分子量为１４５ Ｋ Ｄ，１９２ Ｋ Ｄ 和２６３ Ｋ Ｄ， 并均能被 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的高免血清识别， 这与国外的同类报道很相似。

猪生殖与呼吸综合征病毒HN／XT／07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药),探讨其抗PRRSV的作用机制。结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01)。在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05)。金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15。证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系。

猪生殖和呼吸系统综合征的血清学调查

采用IDEXX公司生产的ELISA试剂盒对 2 0 0 1年 8月至 2 0 0 2年 8月湖北、河南、福建、浙江等省的大中型猪场猪生殖和呼吸系统综合征 (PRRS)的流行情况进行了血清学调查。共检测84 4份血清 ,检出阳性 382份 ,阳性率为 4 5 .2 6 %。其中湖北省猪场的 6 6 1份血清 ,检出阳性 2 4 9份 ,阳性率 37.6 7%。 4 83份种猪血清 ,检出阳性 2 4 4份 ,阳性率 5 0 .5 2 % ,36 1份仔猪血清 ,检出阳性 14 1份 ,阳性率 4 0 .0 6 %。在被检的 5 0个猪场中 ,检出PRRS血清学阳性猪的猪场 4 1个 ,占 82 .0 0 % ,其中湖北省的 38个猪场 ,检出PRRS阳性的 2 9个 ,阳性率 76 .32 %。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立

应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb-A61,McAb-C65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与商品化的PRRSV RT-PCR鉴别试剂盒进行比较。结果显示,McAb-C65与PRRSV美洲株和高致病性PRRSV毒株均呈阳性反应;McAb-A61与PRRSV美洲株呈阳性反应,但不与高致病性PRRSV毒株发生反应;2株单抗都不与欧洲株反应;IFA与RT-PCR的符合率为100%。表明,建立的PRRS间接免疫荧光鉴别诊断方法可为临床高致病性PRRS的确诊提供可靠的验证手段。

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。

猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗不同接种途径对母猪生殖道黏膜淋巴细胞分布的影响

16头 5月龄长白×大约克夏二元杂交母猪 ,通过不同途径接种猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)弱毒疫苗 ,采用组织学方法研究其对母猪生殖道黏膜淋巴细胞分布的影响。结果表明 ,与对照组相比 ,鼻腔和肌注接种可使猪子宫角、子宫体和子宫颈黏膜上皮内淋巴细胞的数量极显著增加 (P <0 0 1 ) ,生殖道接种则使淋巴细胞的数量极显著减少(P <0 0 1 )。鼻腔与肌注接种间无明显差异。经生殖道接种疫苗时 ,子宫黏膜上皮变得不规则 ,有些部位上皮变薄。而经鼻腔和肌注接种时 ,黏膜固有层中多见淋巴细胞聚集 ,形成淋巴细胞群 ,并向黏膜腔表面排放。

猪生殖与呼吸综合征病理损害与免疫抑制观察

对自然感染猪在进行流行病学调查、血清学检测和病原鉴定后 ,将确定为生殖 呼吸综合征 (PRRS)病猪 38头进行病理解剖 ,观察其病变组织和器官的剖检变化以及在普通光镜、电镜下的病理变化 ,并对病猪外周血淋巴细胞进行计数 ;同时设 8头健康猪进行对照。观察发现 ,病猪的免疫器官和细胞系统地遭受了严重的损伤 ,其中淋巴结、脾表现出坏死性炎症变化 ;血管内皮细胞肿胀、增生或坏死、脱落 ;病猪外周血淋巴细胞较健康猪明显减少 (P <0 .0 5 ) ,且多出现变性和坏死。提示PRRS可引起明显的免疫抑制。

猪生殖与呼吸综合征油乳剂灭活疫苗的制备及安全性试验

用本中心分离鉴定的猪生殖与呼吸综合征 (PRRS)强毒株接种Marc-145细胞,制备病毒抗原液,毒价不低于10-7.0TCID50/0.1mL。经一定浓度的甲醛溶液灭活后与油佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗3批。经对该制品的安全性能测定 ,结果表明该品对初生仔猪、断奶仔猪及妊娠母猪3倍剂量注射,均未出现不良反应,安全性良好 ;对母猪的繁殖性能不产生影响。