猪胆囊收缩素与生长抑素的融合表达与鉴定

研究旨在运用原核表达系统制备重组猪胆囊收缩素与生长抑素融合蛋白(rpCCK-SS)。人工合成猪胆囊收缩素与生长抑素融合基因(pCCK-SS),分别克隆至pET28a和pCold GST载体中,转化BL21 (DE3)或Transetta (DE3),构建重组表达菌株,采用双酶切和测序鉴定;并通过进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定优化诱导剂浓度和诱导时间。结果显示,pCCK-pSS基因全长693 bp,共编码231 aa;BL21 (DE3)-pET28apCCK-SS表达目的蛋白分子量25 kDa,以包涵体形式存在;Transetta (DE3)-pCold-pCCK-SS表达目的蛋白分子量50 kDa,在上清与沉淀中均有表达,以沉淀中的包涵体形式为主,最优表达条件为15℃、0.25 mmol/L IPTG浓度诱导8 h。研究表明,试验成功运用两个表达载体表达了rpCCK-SS,且pCold GST的表达效果优于pET28a,为进一步开发新型促生长制剂奠定了基础。

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素(Myostatin,MSTN)基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞(PK15细胞),用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。