猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物,通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(bog cholera lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段,并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接,一并克隆到pPoly2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明,HCLV基因组长度共12310bp,有一个大的ORF,编码一3898个氨基酸的多聚蛋白。其5'-NCR和3’-NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较,HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT,该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明,毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。

中国猪瘟兔化弱毒株(C-株)兔脾组织毒主要保护性抗原E2(gp55)基因序列分析

利用反转录 (RT)及套式PCR(N PCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株 (C 株 )兔脾组织毒主要保护性抗原E2 (gp55)基因 ,成功地将其克隆并测定了核苷酸序列 ,与国内外已发表的猪瘟病毒 (HCV)E2基因序列比较的结果是 :C 株兔脾毒与C 株细胞 (SK6)毒、C 株疫苗 (犊牛睾丸细胞 ,HCLV C)毒、HCV SM株 (石门 )毒、Brescia株 (荷兰 )毒、Alfort株 (德国 )毒的E2核苷酸序列同源性分别为 98 87%、98 34 %、94 58%、91 0 0 %、80 78% ;氨基酸同源性分别为 98 95%、97 37%、94 2 2 %、91 60 %、89 2 3%。对C 株兔脾毒与C 株细胞毒、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较 ,其结果为 :C 株兔脾毒与C 株细胞毒的差异很小甚至没有差异 ,而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和 90年代流行毒之间有明显的差异 ,表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。

猪瘟兔化弱毒抗体对不同野毒株体内外中和保护试验的相关性研究

将猪瘟兔化弱毒疫苗阳性血清与猪瘟野毒株HeBZJK1.95、GZGD1.95、HeBHH2.95、BJXC1.95、HeNBY1.96、BJCY1.96、BJSY2.96、BGTX3.96、HeNXH2.98、FJFQ1.99、JL1.94和标准石门株在PK-15单层细胞上进行中和试验,测定了猪瘟病毒抗体在体外对野毒株的中和作用能力.结果表明,阳性血清对HeBZJK1.95、GZGD1.95、B.JSY2.96、JL1.94和石门株的中和效价为1:256,对BGTX3.96株为1:128,对HeBHH2.95、BJCY1.96、HeNXH2.98株为1:64,对BJXC1.95株为1:16,对FJFQ1.99株为1:8,对HeNBY1.96株为1:4.由此表明,对不同毒株血清中和效价不同.另外测定了猪体内免疫抗体与免疫保护力的关系.采用1头份猪瘟兔化弱毒疫苗主动免疫没有母源抗体的猪,免疫后14 d和192 d抗体滴度<1:16,攻击野毒HeNXH2.98株,仔猪能够完全保护.采食初乳的2组仔猪,母源抗体滴度为<1:16～1:64,分别免疫2头份和4头份猪瘟兔化弱毒疫苗,免疫后抗体滴度均下降1～2个滴度(1头母源抗体滴度低的仔猪,免疫4头份后由<1:16达到1:16).攻击野毒HeNXH2.98株后,免疫2头份的仔猪,不管免疫后抗体水平多高(<1:16～1:64),均不完全保护;免疫4头份的仔猪,免疫后抗体滴度较低(1:8)时,不完全保护;抗体滴度≥1:16时,能够完全保护.动物免疫保护试验表明,1头份疫苗免疫抗体水平能起到良好攻毒保护作用,但母源抗体会影响疫苗免疫抗体水平和攻毒保护效果.

猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测

为了鉴别猪瘟病毒(CSFV)野毒感染和疫苗接种,系统比较分析CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异,设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法.LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂或者琼脂糖凝胶电泳进行检测.该方法特异性好,比RT-PCR灵敏度高出1 000倍,且重复性稳定性良好,为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法.

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法.结果表明:该方法检测的最低拷贝数为45拷贝/μL,灵敏度比普通PCR方法高104倍,在较广的范围内(4.5×101～4.5×106拷贝/μL)有良好的线性关系(r=0.994);分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒作为模板进行TaqManRT-PCR扩增,未出现阳性信号;4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1.90%～5.82%,组间试验变异系数为4.02%～5.69%;HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3.72%～4.93%;组间试验变异系数为2.99%～4.02%.该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具.

猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定

用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C 株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK 6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定。结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性。猪瘟病毒C 株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具。

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株E0糖蛋白基因的克隆及序列分析

参考已发表的猪瘟病毒序列，设计并合成了一对引物，应用ＲＴＰＣＲ 技术，扩增了猪瘟兔化弱毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ ｌａｐｉｎｉｚｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ ， ＨＣＬＶ） 和石门强毒株的Ｅ０ 糖蛋白基因，并将其克隆到ｐＧＥＭＴ 载体中，测定了其核苷酸序列，并推导了其氨基酸序列。结果表明我国这两株强弱不同毒株Ｅ０ 糖蛋白核苷酸序列同源性和推导的氨基酸序列同源性分别为９５－０ ％ 和９４－３ ％ ，有１３ 个氨基酸的差异，ＨＣＬＶ 比石门株多了一个潜在的Ｎ糖基化位点。将我国这两株病毒与国外已报导的ＨＣＶ 毒株Ｅ０ 基因序列进行了比较，发现石门株与日本的两株毒株ＡＬＤ 和ＧＰＥ－ 同源性较高，核苷酸序列同源性分别为９７－４ ％ 和９６－５ ％ ，氨基酸同源性分别为９７－４ ％ 和９６－０ ％ ，而与欧洲Ｂｒｅｓｃｉａ 株和Ａｌｆｏｒｔ 株同源性较低，核苷酸同源性分别为９２－２ ％ 和８６－５ ％ ，氨基酸同源性为９５－２ ％ 和９２－５ ％ ， ＨＣＬＶ 与ＡＬＤ、ＧＰＥ－ 、Ｂｒｅｓｃｉａ、Ａｌｆｏｒｔ 株核苷酸同源性分别为９５－６ ％ 、９４－９ ％ 、９１－３ ％ 、８５－５ ％ ，推导的氨基酸同源性分别为９３－４ ％ 、９２－５ ％

我国猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0基因的克隆及序列测定

采用异硫氰酸胍一步法从４８０代猪瘟病毒兔化弱毒株（ＨＣＬＶ）脾毒中提取总ＲＮＡ，以该ＲＮＡ为模板，进行反转录，然后采用套式ＰＣＲ扩增出ＨＣＬＶ的囊膜糖蛋白Ｅ０基因，琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将扩增出的Ｅ０基因克隆到ｐＧＥＭＴ载体中，用自动序列分析仪对其进行序列测定。将测得的序列及推导的氨基酸序列与国外测得的Ｃ株相应序列进行比较，结果发现，它们之间核苷酸序列同源性为９９．０８％，氨基酸序列同源性为９８．４２％。

应用免疫金银技术检测猪瘟病毒兔化弱毒株感染细胞

在应用免疫金银染色技术成功地对猪瘟病毒弱毒疫苗Thiveral株（CSFV．T株）感染的PK－15细胞进行检测的基础上，通过改进免疫金银反应的条件，进一步提高了免疫金银法的检测灵敏度和特异性。目前已将该技术应用到对猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（CSFVC株）感染细胞的检测，获得较为满意的实验结果。免疫金银染色技术的应用为研究CSFV在细胞中增殖的规律提供更为灵敏的检测手段，并且可望为猪瘟疫苗生产中的滴度测定提供一种简便有效的手段。

中国株猪瘟兔化弱毒克隆毒的研究

采用终点稀释单细胞微量培养法对中国株猪瘟兔化弱毒(C株)进行克隆,获10个克隆株;保持原C株的免疫原性和其他优良特性;在某些方面并有所提高。随机取6号克隆毒(简称C_6)进行系列试验,结果表明;(1)对牛睾丸细胞敏感,共收毒批次和合格批次为15/19(79.9%)(2)用兔增殖毒共归兔64只,发热率为90.6%,用睾丸细胞增殖毒对38只免热反应率为89.47%,(3)按"规程"安检和增大一倍量对猪均无不良反应。(4)C_6细胞毒用兔和猪效检均达5×10^(-4)/1ml合格;呈平行关系。(5)对猪3天即产生免疫。(6)对猪免疫9个月、12个月全保护,16个月亦有75%保护。(7)田间试验1.7万头猪,区域试验38万头猪,均安全有效。(8)对四个疫点使用一个常用量预防,均能控制疫情。综合以上试验结果,表明,C_6株可作疫苗生产用种毒。

接种猪瘟兔化弱毒株的永生化猪血管内皮细胞传代情况研究

在传至70代的永生化猪血管内皮细胞接种猪瘟兔化弱毒,72 h后收取细胞上清液并对处理的细胞进行传代培养,分别检测第70、75、80、90、100、105代接毒细胞中病毒,观察各代细胞的生长情况。结果表明,接种猪瘟兔化弱毒后20代(第90代永生化猪血管内皮细胞)的细胞与正常的形态相似,但传至接毒后35代(第105代永生化猪血管内皮细胞)时,细胞稍有拉长现象。各代次细胞中都有猪瘟兔化弱毒的检出。本研究为永生化猪血管内皮细胞生产猪瘟兔化弱毒疫苗奠定了基础。

猪瘟兔化弱毒株E^(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。

猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)——10年回眸

1猪瘟及C株疫苗概况猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病,给许多国家的养猪业造成了重大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的动物疫病名录。在国务院印发的《国家中长期动物疫病防治规划(2012~2020年)》中,将猪瘟列为5种优先防治的“一类动物疫病”之一。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。

基于mRNA-Seq技术分析猪瘟兔化弱毒株感染家兔后脾脏转录组学变化

为了探究猪瘟兔化弱毒株(Chinese strain, C株)在家兔体内的病毒清除机制,试验以新西兰兔为材料,适应性喂养7 d后随机分为3组,即1个对照组和2个试验组,每组6只。2个试验组家兔分别在感染C株后第5天和第9天耳缘静脉注射空气处死,取出脾脏,获得T1和T2样本,采用TRIzol法提取脾脏总RNA,利用mRNA-Seq技术对家兔脾脏进行转录组测序与分析,以正常家兔基因组为参考,筛选出差异表达基因并进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析,并利用实时荧光定量PCR方法对部分差异基因进行验证。结果表明:与对照组相比,感染C株后T1样本获得的上调基因和下调基因分别有61个和25个,T2样本分别有22个和8个。T1样本差异基因映射到109个GO条目,T2样本差异基因映射到61个GO条目,T1和T2样本差异基因均富集到代谢过程和细胞进程。T1样本差异基因主要富集在趋化因子信号通路、细胞因子与其受体通路、细胞周期通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路和Toll样受体信号通路,T2样本差异基因主要富集在精氨酸和脯氨酸代谢通路、维生素B6代谢通路以及钙信号通路。实时荧光定量PCR验证结果与mRNA-Seq技术的分析结果基本一致。说明家兔感染C株后,T1样本主要通过免疫反应抵抗、清除病毒,T2样本主要通过细胞代谢相关基因的调控来恢复机体细胞的正常功能。

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒(CSFV)及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据Gen Bank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性(翠绿色),其他非CSFV样本的检测结果均为阴性(桔红色),且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。