提高猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗原料兔质量的技术措施

猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗的免疫效果优于猪瘟弱毒细胞苗，特别是用于母猪的加强免疫和有母源抗体小猪的免疫，其免疫效果更好，是猪瘟防疫的最重要的疫苗品种之一。2007年9月，猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗被农业部定为政府采购推广应用的首选疫苗，多家生药厂争着生产，但合格的兔源仍是瓶颈。笔者等对提高脾淋疫苗原料兔质量的技术措施进行了研究，现总结报导如下。

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。

中国猪瘟兔化弱毒株(C-株)兔脾组织毒主要保护性抗原E2(gp55)基因序列分析

利用反转录 (RT)及套式PCR(N PCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株 (C 株 )兔脾组织毒主要保护性抗原E2 (gp55)基因 ,成功地将其克隆并测定了核苷酸序列 ,与国内外已发表的猪瘟病毒 (HCV)E2基因序列比较的结果是 :C 株兔脾毒与C 株细胞 (SK6)毒、C 株疫苗 (犊牛睾丸细胞 ,HCLV C)毒、HCV SM株 (石门 )毒、Brescia株 (荷兰 )毒、Alfort株 (德国 )毒的E2核苷酸序列同源性分别为 98 87%、98 34 %、94 58%、91 0 0 %、80 78% ;氨基酸同源性分别为 98 95%、97 37%、94 2 2 %、91 60 %、89 2 3%。对C 株兔脾毒与C 株细胞毒、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较 ,其结果为 :C 株兔脾毒与C 株细胞毒的差异很小甚至没有差异 ,而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和 90年代流行毒之间有明显的差异 ,表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的影响

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂对60日龄体重18～20 kg的仔猪进行免疫试验研究.B淋巴细胞和抗体水平监测结果表明,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多,血清抗体水平提高.攻毒试验表明,参试的2批猪,试验组潜伏期(34～72 h和36～68 h),明显长于对照组(12～48 h和14～48 h),发热温度试验组为(40.5～40.9℃和40.6～40.8℃)低于对照组(41.4～42.0℃和41.2～41.7℃),高热期试验组为(30～96 h和46～98 h)低于对照组(72～148 h和72～146h).说明苜蓿多糖对猪瘟疫苗免疫效果具有明显的强化作用.

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物,通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(bog cholera lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段,并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接,一并克隆到pPoly2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明,HCLV基因组长度共12310bp,有一个大的ORF,编码一3898个氨基酸的多聚蛋白。其5'-NCR和3’-NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较,HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT,该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明,毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒(CSFV)及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据Gen Bank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性(翠绿色),其他非CSFV样本的检测结果均为阴性(桔红色),且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。

猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测

为了鉴别猪瘟病毒(CSFV)野毒感染和疫苗接种,系统比较分析CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异,设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法.LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂或者琼脂糖凝胶电泳进行检测.该方法特异性好,比RT-PCR灵敏度高出1 000倍,且重复性稳定性良好,为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法.

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。

荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应。荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5 h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫应答强化作用的研究

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂 ,对 6 0日龄体重 1 8～ 2 0kg的仔猪进行免疫试验。结果表明 ,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多 ,IgG水平提高 ,可显著增强猪瘟疫苗的免疫效果。

中国猪瘟兔化弱毒兔脾毒NS2-3基因的序列分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了覆盖有 NS2 - 3全基因的 4对引物 ,应用RT -PCR技术从接种了猪瘟兔化弱毒 (hogcholeraviruslapinizedChinesestrain ,HCLV)的兔脾组织中 ,成功地扩增了 NS 2 - 3基因 ,将其克隆到T载体后 ,测定了其核苷酸序列。结果显示 ,所克隆的NS 2 - 3基因长 2 96 4个核苷酸 ,编码 988个氨基酸。用DNASIS和PROSIS软件分析表明 ,该基因具有丝氨酸类蛋白酶活性及含有解旋酶超家族特征性保守序列。核苷酸序列同源性分析表明 ,HCLV与国外报导的 8株HCV毒株“C”、Riems、ALD、GPE、Glentorf、CAP、Brescia和Alfort株NS 2 - 3基因核苷酸序列同源性分别为 99%、99%、96 %、96 %、95 %、95 %、94%和 86 % ,推导的氨基酸序列同源性分别为 99%、99%、98%、98%、98%、97%、97%和 95 % ,氨基酸序列的高度同源性表明了NS 2 - 3是猪瘟病毒中高度保守的蛋白质之一 ,这与该基因产物参与病毒复制及多聚蛋白前体加工过程中的重要作用相对应。

猪瘟兔化弱毒免疫猪淋巴细胞亚类及转化水平、IFN-γ的变化与分析

为研究免疫猪瘟兔化弱毒(HCLV)对猪细胞免疫应答的影响,本研究分别采用HCLV脾淋毒单独(A组)、HCLV细胞毒与兔脾淋组织液联合(B组)、HCLV细胞毒单独(C组)及生理盐水(对照组)免疫仔猪,应用流式细胞术、淋巴细胞增殖试验及ELISA方法测定免疫前后外周血淋巴细胞(PBL)亚类比值、PBL非特异性(NSI)及特异性(SSI)刺激指数、IFN-γ浓度。结果显示免疫后各组CD3+/PBL与CD3+CD8+/PBL差异不显著;CD3+CD4+/PBL于第7 d时A、B和对照组显著高于C组(p<0.05);CD3+CD4+/CD3+CD8+于第7 d、14 d时A、B和对照组显著高于C组(p<0.05),并且C组CD3+CD4+/CD3+CD8+显著降低(p<0.05);NSI于第3 d、7 d时A与B组显著高于C组(p<0.05),而C组显著高于对照组(p<0.05);SSI于第3 d、7 d时A组显著高于B与C组(p<0.05),而B与C组显著高于对照组(p<0.05);IFN-γ含量由高至低依次为:A、B、C和对照组,并且于第3 d、7 d时差异显著(p<0.05)。研究结果表明,HCLV细胞毒引起机体CD3+CD8+相对更快速增殖,而HCLV脾淋毒引起机体CD3+CD4+相对更快速增殖及NSI、SSI、IFN-γ浓度更高,脾淋毒与细胞毒可能侧重不同的免疫分子途径发挥免疫保护效力;兔脾淋组织液对NSI和IFN-γ浓度具有增强作用。

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法.结果表明:该方法检测的最低拷贝数为45拷贝/μL,灵敏度比普通PCR方法高104倍,在较广的范围内(4.5×101～4.5×106拷贝/μL)有良好的线性关系(r=0.994);分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒作为模板进行TaqManRT-PCR扩增,未出现阳性信号;4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1.90%～5.82%,组间试验变异系数为4.02%～5.69%;HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3.72%～4.93%;组间试验变异系数为2.99%～4.02%.该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具.

不同批猪瘟活疫苗中猪瘟兔化弱毒E2基因主要抗原编码区序列分析

对 1 2批猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒病毒 ,以 RT- PCR获得了 E2基因的主要编码区的大约 2 5 0 bp大小的节片 ,在 DNA star上对这些节片的 2 1 1 pb进行了测序 ,观察到这些节片的编码序列高度同源性。其核苷酸序列和氨基酸序列有 98.1 %～ 1 0 0 %相同 ,其中 9批完全一致 ,结果表明猪瘟兔毒疫苗株的分子结构极其稳定。

蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果影响的试验观察

为观察蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的调节作用,选择高、中、低剂量(0.2mL/kg、0.1mL/kg、0.05mL/kg)的蟾酥注射液与猪瘟兔化弱毒疫苗联合使用作试验组,猪瘟兔化弱毒疫苗组、猪瘟兔化弱毒疫苗与盐酸左旋咪唑+黄芪多糖组、空白组作为对照。试验猪在用药前及首次用药后的7d、14d、21d、28d,通过静脉采集血液,用试剂盒检测血清中猪瘟免疫抗体效价和IL-2水平。结果显示,蟾酥注射液高、中剂量组能够显著提高接种猪瘟兔化弱毒疫苗猪的血清中抗体水平(p<0.05);不同剂量蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫猪血清IL-2的产生具有不同程度的促进作用,其中蟾酥注射液高剂量组作用快,持续时间较长。本试验的结果说明蟾酥注射液是猪瘟兔化弱毒疫苗有效的免疫佐剂。综合考虑,推荐蟾酥注射液的临床应用剂量为肌内注射0.1mL/kg体重,1日2次,连用3日。

影响猪瘟兔化弱毒细胞疫苗生产的原因分析

本公司2001年生产猪瘟兔化弱毒细胞疫苗27批,效力不合格报废1批,污染报废1批。成品合格率为92 6%。制备原代细胞24批(144瓶),由于各种原因造成原代细胞不形成单层的有10批(63瓶),成功率为56 3%;次代细胞失败的有3批(89瓶),次代细胞成功率仅为68 6%;而不产毒的细胞有2批(43瓶),产毒率为74 5%。本文就引起猪瘟兔化弱毒细胞疫苗生产失败的主要原因进行了分析。