非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同温度保存下对实验结果的影响

目的:比较非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同低温保存下对检测结果的影响。方法:将同一生产厂家同一批号的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒分别置于4℃和-18℃下保存24 h以上后对养殖场送检的12份猪血清样品进行检测,比较其OD值和结果差异。结果:这两种储存温度下的实验均成立且判定结果一致,但OD值存在一定的偏差。

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化,将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体,采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清,通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示,该方法的临界值为25.62%时,ROC的曲线面积最大,为0.9989,诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清,结果显示,除ASFV阳性血清外,其他阳性血清均为阴性,表明特异性强;利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4~1∶2048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测,结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致,敏感性高。利用该方法对3份灭活的ASFV阳性血清进行批内和批间的重复性检测,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性好。利用该检测方法和商品化试剂盒同时检测216份临床血清样品,两种方法检测结果符合率为99.07%。本研究所建立的阻断ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于ASFV抗体的检测,为非洲猪瘟流行病学调查及弱毒株疫苗抗体评价提供技术支撑。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG_(1)/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10^(5)。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和常数(Ka)为9.68×10^(8)L/mol。初步建立的阻断ELISA试验显示,36A3能够有效区分阴阳性血清,N/P高达12.53,提示其为非常有效的阻断ELISA候选抗体。本试验结果为深入研究非洲猪瘟病毒CD2v蛋白功能及研发非洲猪瘟病毒阻断ELISA血清学检测试剂盒奠定了基础。

阻断ELISA法检测非洲猪瘟抗体

非洲猪瘟(ASF)是我国重点防范的外来动物疫病,目前我国尚无疫情发生,为防患于未然,仍需加强病原监测。本试验采用西班牙Ingenasa非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒对来源于四川省内的92份猪血清进行检测,结果表明92份血清样本均为ASFV抗体阴性。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均<10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法。采用原核表达的ASFV p54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价。结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0μg·mL^(-1),抗原包被温度及时间为4℃过夜,被检血清稀释度为1∶40,酶标单抗稀释度为1∶1000,被检血清作用时间为1 h,酶标单抗作用时间为30 min,底物作用时间为10 min。经阴、阳性样品检测和特异性、敏感性试验,当临界值阻断率≥55.2%时,判定为阳性,当阻断率<43.4%时,判定为阴性,介于两者之间判定为可疑。该方法与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应,特异性好。批内重复试验及批间重复试验的变异系数(CV)均在10%以内。将该方法进行初步应用,并与商品化ELISA试剂盒进行符合性试验,两者的检测符合率为98%。综上表明,建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV临床样品的抗体检测。

阻断ELISA与中和试验检测猪瘟疫苗免疫猪血清抗体的比较

应用阻断ELISA和中和试验2种不同的方法对猪瘟疫苗免疫前后的猪血清抗体进行了检测,在所检测的6头仔猪免疫前和免疫后的12份血清中,2种方法的检测结果相符。应用Western blot对部分血清进行了验证,结果与2种方法检测结果一致,表明阻断ELISA和中和试验结果确实、特异,能真实反映免疫猪群的抗体水平。

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准:当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。

猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒(CSFV)E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。

胶体金法与ELISA法检测猪瘟抗体结果对比分析

为了比较胶体金法与ELISA法检测猪瘟抗体的结果符合率,以了解胶体金法的特异性与敏感度,用胶体金法和ELISA法平行检测受检猪血清标本猪瘟抗体滴度。结果表明,胶体金法和ELISA法检测猪瘟抗体的结果符合率为86.6%,用胶体金法检测猪瘟抗体存在漏检及误诊(即假阴性、假阳性)。说明胶体金法较ELISA法敏感度、特异度低,用胶体金法检测猪瘟抗体滴度存在一定程度的漏检率及误诊率,胶体金法只能初步筛查猪瘟抗体,有一定技术力量的县级兽医实验室使用ELISA法检测猪血样的猪瘟抗体滴度更为合适,对于胶体金法筛查阴性的猪血样,建议用ELISA法复检以防漏检。

猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测及注意事项

猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测是检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体水平的一种方法,是检验免疫效果的重要依据。检测过程中如果不严格遵守操作规程检测,将对检测结果产生影响,现将本人多年来检测操作及注意事项归纳如下,供大家参考。1样品准备血清稀释板中,用样品稀释液按1：1比例稀释待检血清、阳性和阴性对照血清（例如.

固相阻断ELISA法检测口蹄疫病毒O型抗体的不确定度评定

目的:以口蹄疫病毒O型抗体(固相阻断ELISA法)检测的不确定度评定为例,以两种方法评定检测的不确定度。方法:分别使用“影响因素分析法”和“对照样品法”对检测口蹄疫病毒O型抗体的不确定度进行评定。结果:“影响因素分析法”的合成不确定度为0.1297,扩展不确定度为0.2593;“对照样品法”的合成不确定度为0.1040,扩展不确定度为0.2080。结论:对新方法进行不确定度评定时,“影响因素分析法”更适用,可帮助检测员更了解试验过程及注意事项,而“对照样品法”直接评估该试验过程的合成不确定度,减少大量计算过程,快速得出结论。

两种不同检测法对猪瘟抗体阴性猪筛检的比较

猪瘟抗体阴性猪是猪瘟活疫苗安检的重要实验动物,目前对于猪瘟抗体阴性猪筛选是采用兔体中和反应法,实验复杂,工作量大并且易受实验兔个体差异等因素影响。随着生物学及其技术的发展,ELISA被广泛用于生物制品的各个领域。本试验应用ELISA法和兔体中和反应法对猪瘟抗体阴性猪进行筛选,共检测160份血清,检测结果显示两种方法结果有很高的一致性,但ELISA法更为敏感,快捷,更适用于猪瘟抗体阴性猪的筛选。

应用ELISA检测珠海市供港澳猪猪瘟抗体

猪瘟在我省流行比较严重，曾造成较大的经济损失。从1988年后全省采取每年春秋两防的免疫措施。使我省的猪瘟疫情得到了全而的控制。但是猪瘟病例时有发生。为了调查我市供港澳猪猪瘟的免疫情况，应用ELISA方法检测猪瘟免疫抗体。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，国内许多学者、专家通过大量研究探讨，认为ELISA法检测猪瘟抗体与中和试验检测结果基本一致，两者没有明显的差异，较之血清中和试验法具有更大的实用价值。现随机从9个注册猪场共采集90份血样进行ELISA检测．检测情况如下。

应用三种方法筛选猪瘟抗体阴性猪的比较试验

为了寻找筛选猪瘟抗体阴性猪更简便的方法,本试验应用猪瘟中和试验(SN)、阻断ELISA和正向间接血凝(IHA)三种方法分别对170份未经猪瘟活疫苗免疫的仔猪血清进行猪瘟抗体检测。结果显示,SN、ELISA和IHA检测出的猪瘟阴性血清分别为144份、150份和131份,表明三种检测方法有较好的符合率,其中SN与ELISA的检测符合率为90.59%,SN与IHA的检测符合率为82.94%,而ELISA法与另两种方法比较阴性符合率最高。本结果表明,ELISA法具有较高的敏感性,适合应用于猪瘟活疫苗安全检验抗体阴性猪的筛选。

2019年江西省部分地区猪瘟抗体水平调查与分析

目的:对江西省部分地区的猪瘟免疫保护情况做出实验调查。方法:采用猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法。结论:母猪群抗体都比较好,母源抗体整体抗体水平高,阳性率100%;平均阻断率80%;6周龄阳性率46.7%,平均阻断率34.8%,抗体水平处于临界点,保护率不高;9周龄仔猪阳性率93.3%,平均阻断率55.86%,处于正常状态。

不同方法对猪瘟免疫效果验证试验

根据农业部监测计划的规定，猪瘟抗体监测方法是酶联免疫吸附试验（抗体阻断ELISA、抗体间接ELISA）和抗体正向间接血凝试验，许多规模猪场场主偏信宣传，对猪瘟抗体采用正向间接血凝试验监测结果持怀疑态度．因此笔者通过正向间接血凝试验和酶联免疫吸附试验对3个规模化猪场66份血清样品进行了猪瘟免疫效果验证试验。