融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2的表达及鉴定

目前,传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒(减毒)猪瘟疫苗存在免疫保护期短、毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决上述问题。铁蛋白24个亚基可以自组装成稳定的多聚体纳米颗粒,成为理想的抗原呈递载体和疫苗开发平台。基于此,将铁蛋白与具有较强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2(具有高保守性的保护性抗原)结合,构建融合基因E2-Fe,将该基因克隆到pET28a原核表达载体中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导条件的探索及其高效表达,再将表达的融合蛋白进行镍柱纯化、质谱分析、Western-blotting验证及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到pET-28a载体上,0.50%乳糖诱导6 h为融合蛋白E2-Fe表达的最优条件;质谱分析与Western-blotting均显示融合蛋白的大小约为51 kD,与理论值相符;电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm。结果表明,融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2在大肠杆菌中得到高效表达,经镍柱纯化后可获得数量可观的自组装纳米颗粒抗原,为研究新的猪瘟疫苗拓宽了研究思路。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2的锚定序列部分缺失对其在细胞内表达的影响

为了将猪瘟病毒(CFSV)的囊膜蛋白表达在细胞表面,本研究根据与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的囊膜蛋白E2锚定序列,推测出CSFV的E2锚定序列。利用生物信息学软件对CSFV的E2锚定序列进行分析、建模与部分缺失,构建成4种不同的表达CSFV囊膜蛋白EmsE1E2的片段。将以上4种片段分别连接到真核表达载体pCAGGS中,转染幼仓鼠肾(BHK21)细胞,利用抗E2蛋白的单克隆抗体对表达蛋白进行westernblot检测与间接免疫荧光(IFA)检测,研究结果表明:跨膜区中锚定序列的部分缺失会降低E2在细胞内的表达,为猪瘟伪型病毒的研制提供了实验依据。

猪瘟病毒中和抗体与E2蛋白抗体相关性分析

旨在探索猪瘟病毒中和抗体与E2蛋白抗体的关系,本研究对289份猪血清进行中和抗体效价和E2抗体测定,比较分析二者的相关性;同时从中选取15份血清,测定血清对不同猪瘟病毒流行野毒株的中和效价。结果表明,从整体上说E2抗体水平与中和效价呈正相关。当群体中所有个体E2抗体阻断率均大于60%时,才能保证群体70%以上免疫猪的中和抗体达到保护标准。本研究的结果有助于基层兽医工作者更好地评估临床中猪瘟疫苗的免疫保护状况,降低猪瘟疫情发生风险。

3种佐剂对猪瘟病毒E2蛋白免疫效果的影响

为筛选猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)亚单位疫苗高效佐剂,将杆状病毒表达系统制备的重组CSFV E2蛋白分别与铝佐剂(胶状)、50V佐剂(W/O)和201佐剂(W/O/W)3种不同佐剂配伍后免疫Balb/c小鼠,经间接ELISA和阻断ELISA测定抗体效价及血清IL2、IL4、IL10和IFN-γ细胞因子水平。结果显示,经Ni-NAT亲和层析纯化获得的重组E2蛋白纯度约95%;免疫后28 d,无佐剂的E2蛋白免疫Balb/c小鼠后抗体效价达到1∶3200,但血清抗体阻断率小于30%;加入佐剂后,抗体效价明显提升,血清抗体阻断率也随之升高,3种不同的佐剂免疫血清抗体阻断率大于40%。其中50V佐剂组抗体效价最高可达1∶204800,其抗体阻断率大于80%,且50V佐剂组免疫血清中IL-4表达量最高为892.23 pg/mL,说明50V佐剂可以有效激发以Th2型免疫应答为主的细胞免疫反应。综合B细胞和T细胞免疫应答结果,50V佐剂对E2蛋白的免疫效果提升明显优于其他佐剂,试验结果为进一步研究高效猪用CSFV亚单位疫苗奠定了基础。

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

基于重组牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2的间接ELISA检测方法建立

为建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的间接ELISA方法,本试验将纯化后的重组BVDVE2蛋白作为抗原包被96孔酶标板,采用方阵滴定法优化间接ELISA的各项反应参数初步建立检测方法,并进一步分析了该方法的特异性、敏感性和重复性。确定的最佳ELISA反应条件如下:抗原包被浓度为1.5μg/mL,1:100稀释待检血清于37℃孵育1 h,1:6 000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG于37℃作用1 h,确定阴、阳性血清临界OD450 nm值分别为0.203和0.226。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与商品化试剂盒的检测符合率达96%,该方法可以用于BVDV抗体的检测和试剂盒的进一步研制。

基于E2蛋白A-D抗原区检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立与应用

本研究以猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区E2 A-D为包被抗原,建立一种可特异性检测猪瘟(CSF)抗体的间接ELISA方法。该方法中抗原包被浓度为0.75μg/mL,检测血清稀释倍数为1:150。对123份兔体中和试验测定为阴性的样本进行临界值测定,确定OD450nm≥0.38为阳性,OD450nm≤0.31为阴性,0.31<OD450nm<0.38为可疑。对该方法的特异性、重复性和敏感性进行检验,同时与兔体中和试验结果进行平行比较,检测该方法的准确性。结果表明,本研究可为CSF血清抗体提供一种可替代、特异、稳定的血清学检测方法。

家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV) HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ (E2^(Domain Ⅰ))是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain Ⅰ中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen (SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2^(P108L-T109I))及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育,经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定,结果却意外发现,CSFV SM E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带;质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1 (ANXA1),且与CSFV SM E2蛋白之间可能存在相互作用。为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用,将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔,48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC),采用RT-q PCR方法检测ANXA1基因m RNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,家兔在接种SM株和HCLV株后,ANXA1基因m RNA转录水平均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下调,且与接种HCLV株的家兔相比,接种SM株家兔中ANXA1基因m RNA的转录水平极显著(P<0.001,72 h)或者显著(P<0.05,48 h)下调,表明接种SM株后的家兔可能通过调控ANXA1的转录水平抑制SM株的复制。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞,48 h后收集细胞样品,通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为强毒实验组,将pCAGGS-Myc-HCLV E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组,48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。上述结果进一步表明,ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用,但其与HCLV E2无相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组,采用激光共聚焦显微镜观察发现SM E2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中。将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞,48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株,采用RT-q PCR检测CSFV基因的拷贝数。结果显示,与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比,接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(P<0.01),而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化。表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制,但不影响弱毒株的复制。本研究首次证实,家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SM E2蛋白的相互作用促进CSFV的复制,为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础。

养殖鲫鲤疱疹病毒2型的鉴定及病毒囊膜蛋白ORF131多抗的制备

为了解鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在南京地区养殖场鲫鱼中的发病情况,对南京某渔场疑似CyHV-2感染鱼,采集鳃、肾脏等组织进行解旋酶基因(hel)PCR扩增测序及遗传变异分析;通过蔗糖密度梯度离心从发病鲫鱼组织中提纯病毒粒子,电镜观察其形态;对CyHV-2的10种囊膜蛋白编码基因进行测序,并基于生物信息学分析选择理想的囊膜蛋白进行原核表达,免疫小鼠制备抗血清。结果显示:患鱼组织hel基因检测阳性,其序列与参考株ST-J1毒株hel基因序列(GenBank登录号:JQ85364)高度同源(99.67%),并位于同一进化分支;利用蔗糖密度梯度离心结合Western blot检测发现,病毒粒子存在于40%~46%蔗糖层,电镜观察显示直径在160 nm左右;10种囊膜蛋白中开放阅读框131(ORF131)囊膜蛋白具有一段连续B细胞表位且抗原性良好,将ORF131原核表达、免疫小鼠后制备的抗血清ELISA效价达1∶4000。本研究为南京地区CyHV-2感染的检测和防控提供了依据。

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2研究进展

猪瘟(classical swine fever,CSF)是危害养猪业的主要传染病之一,致病原是猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV),E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要抗原蛋白。本文对E2蛋白的分子结构、抗原特性、对病毒毒力的影响和在进入靶细胞过程中的作用等4个方面的研究现状进行了阐述。

我国丙型肝炎病毒囊膜蛋白E_2高变区1的序列特征

对２３例国内献血员、血透析及肝炎病人血清用反转录巢式ＰＣＲ技术扩增了ＨＣＶＲＮＡ囊膜蛋白２基因的ｃＤＮＡ片段，并进行了序列测定。结果表明２３例病人ＨＣＶＥ２／ＮＳ１Ｎ末端的核苷酸及氨基酸序列呈现多样性，高变区１（ＨＶＲ１）位于核苷酸第１４５９～１５５９位，氨基酸第３８４～４１０位；我国ＨＣＶ株ＨＶＲ１２７个氨基酸中有１５个位置氨基酸相对稳定，氨基酸组成与分布均与Ｓｅｋｉｙａ报道的１６６个ＨＣＶ株的不同。结果提示，研究我国ＨＣＶ株ＨＶＲ１的序列特征有助于ＨＣＶ的流行病学研究，对研制适用于我国的抗体诊断试剂盒及进行疫苗研究均有重要的意义。

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2中和表位的定位及其免疫反应性分析

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。Erns和E2与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程。采用抗CSFV中和性单克隆抗体c24/10,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,结合噬菌体拟位免疫反应性分析结果,对CSFVE2蛋白中和表位进行定位。结果表明:E2蛋白的SPT-TLR基序(832～837位氨基酸)构成CSFV特异性线性中和表位,基序的第一、二、三位氨基酸是表位与单克隆抗体c24/10结合所必需的氨基酸,也是表位的关键性氨基酸。

大肠埃希菌外膜囊泡递呈猪瘟病毒E2蛋白的表达及其免疫效果评价

为探讨大肠埃希菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)作为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的递呈载体所产生的免疫效应,将切除跨膜区后的CSFV E2基因连接到p BAD18-Cm-Cly A的C-端,转化E.coli DH5α,用0.2%阿拉伯糖诱导表达后,收集含E2蛋白的OMVs免疫家兔。免疫印迹表明,该OMVs可特异性地与组氨酸标签单抗结合。间接ELISA结果表明,重组OMVs可诱导兔体产生高水平的Ig G抗体。免疫后的家兔能很好地防御高剂量CSFV活疫苗攻击。说明大肠埃希菌OMVs递呈CSFV E2蛋白具有较好的免疫原性,为研究OMVs递呈CSFV E2蛋白疫苗奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2基因不同高可变区缺失型核酸疫苗的构建

为了构建牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)囊膜蛋白E2基因高可变区(hyper variable region,HVR)缺失型核酸疫苗,为BVDV防控提供新的方法,试验依据GenBank中BVDV基因组序列设计引物,以BVDV新疆分离株TC cDNA为模板,扩增E2基因并测序,使用生物信息学软件分析E2蛋白的跨膜区和HVR区域等;采用常规PCR和搭桥PCR等方法扩增E2基因的不同缺失型HVR区域,并将其插入到真核表达载体pVAX1中,构建成真核表达质粒;分别于0,2,4周时免疫Balb/c小鼠,并在首次免疫后0,14,28,42天采集血清,通过ELISA法测定IgG水平。结果表明:成功扩增出BVDV TC株E2基因,大小为1122 bp;E2基因与BVDV 1b毒株HP-KY-PK13(登录号KT355592.1)及BVDV 1b毒株3156(登录号JN704144.1)的E2基因具有较高的同源性,E2 HVR1区域位于E2基因N端,HVR2区域位于E2基因中间部位;成功构建了E2基因不同的HVR缺失型真核表达质粒pVAX1-E2 HVR1△1-20、△1-64、△21-40、△41-64和pVAX1-E2 HVR2△140-216;与免疫pVAX1相比,E2基因不同HVR缺失质粒及野生型E2质粒诱导的IgG抗体水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);而在首次免疫42天时,用pVAX1-E2 HVR1△41-64免疫诱导的IgG抗体水平最高,约为pVAX1-E2的3.9倍。说明用pVAX1-E2 HVR1△41-64制备的核酸疫苗能诱导动物产生较高水平的IgG。

人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因

以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑叶育相近,SDS-PAGE蛋白质电泳在家蚕幼虫、蛹血淋巴中均检测到1条与目的蛋白理论分子量(63 kD)相符的特异性蛋白条带,初步认为是重组病毒Bm-BacPAK6-E2的融合表达产物.

猪瘟病毒囊膜蛋白基因pcDNA4.0-E重组质粒的构建及其对小鼠的免疫原性

以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR方法,克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2cDNA全序列,并将其与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-E。经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4.0-E,每只100μg,15 d后再注射1次,同时设空白对照组。于二免后第10、203、0 d分别扑杀小鼠,进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验,并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示,与空白对照组相比,所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖(P<0.01),血清抗体水平从二免后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于对照组(P<0.01)。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系。本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24、48h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明:用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。

表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究

为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829~aa837)的融合基因(PCV2-Cap^(169~180)-E2^(829~837))经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化得到单一的目的蛋白;western blot结果显示,重组蛋白能够与猪源PCV2多克隆抗体(PAb)、猪源CSFV PAb及HRP标记的6×His-Tag小鼠单克隆抗体(MAb)发生特异性反应,在49 ku处出现特异性条带;电镜观察可见重组蛋白形成规则的VLP;抗体的ELISA结果显示,与PBS对照相比,VLP能够诱导小鼠产生较高的PCV2及CSFV抗体水平(P<0.01),与各商品化疫苗均无显著差异。细胞因子的ELISA结果显示,与PBS对照组相比,VLP能够诱导小鼠产生较高水平的细胞因子(P<0.01)。体外病毒中和试验结果显示,VLP免疫的小鼠血清中具有中和PCV2的活性。综上所述,本实验首次在大肠杆菌中可溶性表达并获得了纯化的重组蛋白(PCV2-Cap-E2),且其能够在体外自组装成VLP,并可刺激小鼠产生针对PCV2 Cap蛋白及CSFV E2蛋白的特异性抗体,为研制针对PCV2和CSFV的新型二联VLP疫苗提供了物质基础。

猪瘟病毒及其囊膜糖蛋白E_2基因的研究进展

简要阐述近年来猪瘟病毒及其囊膜糖蛋白E2基因在分子生物学、分子免疫学和基因工程疫苗研究领域的最新研究进展。