猪瘟病毒E2蛋白抗原多肽与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

利用 DNA重组技术将猪瘟病毒 (clascical swine fever virus,CSFV) E2蛋白主要抗原编码区基因 (m E2 )与 T4噬菌体 SOC基因融合 ,插入 T4噬菌体表达质粒 ,构建成 T4噬菌体 SOC位点表达 m E2的表达载体 p1Sm E2。将其转化至 BL2 1 (DE3 )菌 ,取经 IPTG诱导后表达的目的蛋白 SDC- m E2进行 SOS- PAGE、薄层凝胶扫描分析、Western blot及 EL ISA等方法检测。结果表明 ,表达的 SOC- m E2蛋白相对分子质量约 2 5 70 0 ,表达量占菌体总蛋白量的 36 .7%,并具有与 CSFV特异性抗体反应的活性。

原核表达的猪瘟病毒E2蛋白抗原多肽的复性和纯化

对原核中以包涵体形式高效表达的猪瘟病毒 (CSFV) E2蛋白抗原表位区段 (m E2 )进行了变性、复性与纯化研究。包涵体经超声破菌分离 ,然后进行变性溶解和复性 ,复性产物经硫酸铵沉淀浓缩后 ,利用免疫亲和层析进行纯化。纯化产物的 SDS- PAGE分析结果表明 ,其纯度达 97%。酶联免疫试验测定的结果显示 ,与复性前变性蛋白相比 ,纯化蛋白与 CSFV特异的单抗和多克隆阳性血清的反应活性提高了 2～ 16倍。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

3种佐剂对猪瘟病毒E2蛋白免疫效果的影响

为筛选猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)亚单位疫苗高效佐剂,将杆状病毒表达系统制备的重组CSFV E2蛋白分别与铝佐剂(胶状)、50V佐剂(W/O)和201佐剂(W/O/W)3种不同佐剂配伍后免疫Balb/c小鼠,经间接ELISA和阻断ELISA测定抗体效价及血清IL2、IL4、IL10和IFN-γ细胞因子水平。结果显示,经Ni-NAT亲和层析纯化获得的重组E2蛋白纯度约95%;免疫后28 d,无佐剂的E2蛋白免疫Balb/c小鼠后抗体效价达到1∶3200,但血清抗体阻断率小于30%;加入佐剂后,抗体效价明显提升,血清抗体阻断率也随之升高,3种不同的佐剂免疫血清抗体阻断率大于40%。其中50V佐剂组抗体效价最高可达1∶204800,其抗体阻断率大于80%,且50V佐剂组免疫血清中IL-4表达量最高为892.23 pg/mL,说明50V佐剂可以有效激发以Th2型免疫应答为主的细胞免疫反应。综合B细胞和T细胞免疫应答结果,50V佐剂对E2蛋白的免疫效果提升明显优于其他佐剂,试验结果为进一步研究高效猪用CSFV亚单位疫苗奠定了基础。

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

基于E2蛋白A-D抗原区检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立与应用

本研究以猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区E2 A-D为包被抗原,建立一种可特异性检测猪瘟(CSF)抗体的间接ELISA方法。该方法中抗原包被浓度为0.75μg/mL,检测血清稀释倍数为1:150。对123份兔体中和试验测定为阴性的样本进行临界值测定,确定OD450nm≥0.38为阳性,OD450nm≤0.31为阴性,0.31<OD450nm<0.38为可疑。对该方法的特异性、重复性和敏感性进行检验,同时与兔体中和试验结果进行平行比较,检测该方法的准确性。结果表明,本研究可为CSF血清抗体提供一种可替代、特异、稳定的血清学检测方法。

猪瘟病毒E2糖蛋白抗原表位的预测、多肽合成及特性研究

目的 :研究CSFVE2蛋白免疫原性肽的生物学特性。方法 :应用计算机分析软件对猪瘟病毒E2糖蛋白的抗原表位进行了预测 ,结合E2基因的变异分析 ,人工合成了两条多肽 (Pep1和Pep2 )序列 ,与抗mE2蛋白的兔血清和抗mE2的 8株单抗进行反应 ,并将两条多肽分别与载体蛋白 (BSA)进行偶联和免疫家兔。结果 :两条多肽均与兔的抗血清及单抗A11反应 ;多肽Pep2与单抗D5和D8反应。多肽Pep1与BSA载体蛋白偶联 (Pep1 BSA) ,免疫家兔后能够产生针对多肽Pep1的抗体。结论 :两条多肽Pep1和Pep2中 。

利用随机肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位

利用噬菌体随机12肽库对抗猪瘟病毒(classical swine fever virus CSFV)糖蛋白E2特异的单抗A11进行表位鉴定,经过4轮筛选后,随机挑取10个噬菌体克隆作竞争ELISA检测.结果表明,10个克隆中除4号克隆外,其余9个均能抑制原核表达的E2蛋白和A11单抗之间的抗原抗体反应,抑制率在35%～64%;DNA测序表明,所有产生竞争抑制作用的8个噬菌体克隆的12肽序列均含有XXWRXXXL核心序列,而没有抑制作用的克隆则不含该核心序列;Western-blot试验证明,所挑阳性克隆均能被单抗A11识别.多序列比较发现,该核心序列与猪瘟病毒E蛋白的28～35位氨基酸TTWKEYSH有一定的同源性,人工合成的含有部分核心序列氨基酸的多肽可以与单抗A11反应,表明单抗A11所针对的抗原表位位于CSFV E2蛋白的28～35位氨基酸.

家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV) HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ (E2^(Domain Ⅰ))是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain Ⅰ中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen (SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2^(P108L-T109I))及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育,经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定,结果却意外发现,CSFV SM E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带;质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1 (ANXA1),且与CSFV SM E2蛋白之间可能存在相互作用。为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用,将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔,48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC),采用RT-q PCR方法检测ANXA1基因m RNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,家兔在接种SM株和HCLV株后,ANXA1基因m RNA转录水平均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下调,且与接种HCLV株的家兔相比,接种SM株家兔中ANXA1基因m RNA的转录水平极显著(P<0.001,72 h)或者显著(P<0.05,48 h)下调,表明接种SM株后的家兔可能通过调控ANXA1的转录水平抑制SM株的复制。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞,48 h后收集细胞样品,通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为强毒实验组,将pCAGGS-Myc-HCLV E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组,48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。上述结果进一步表明,ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用,但其与HCLV E2无相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组,采用激光共聚焦显微镜观察发现SM E2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中。将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞,48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株,采用RT-q PCR检测CSFV基因的拷贝数。结果显示,与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比,接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(P<0.01),而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化。表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制,但不影响弱毒株的复制。本研究首次证实,家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SM E2蛋白的相互作用促进CSFV的复制,为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础。

猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析

应用大肠杆菌表达的猪瘟病毒主要保护性 E2抗原决定簇蛋白和全长 E2基因构建的 DNA疫苗免疫 BAL B/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与 SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经克隆和间接 EL ISA筛选 ,获得了 A11、B2、E3、H6、D5、D86株稳定分泌抗猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞株。它们的腹水效价在 1∶ 80 0～ 1∶ 2 10 0 0 0之间。抗体类型鉴定结果表明 ,A11、E3、H6、D5和 D8为 Ig M类型 ,B2为 Ig G类型。随后用蛋白 A凝胶层析法和 PEG沉淀法分别纯化了 Ig G和 Ig M单抗。对纯化单抗进行的抗原识别表位研究结果初步表明 ,6株单抗可能识别 3种不同的E2抗原表位。

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原域的高效表达及间接ELISA方法的初步建立

重组质粒pET-2e转化宿主菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导表达,比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量,确定其最佳表达条件,使外源基因获得了较高水平的表达,可达菌体蛋白总量的36.6％。Western-blot检测表明表达产物具有良好的免疫反应原性。将收集的纯培养物进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定了目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度,初步建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测,结果显示:使用囊素与疫苗共同免疫猪的血清抗体水平明显高于未加囊素组猪的血清抗体水平,与以往的报道一致,为以CSFV重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法的标准化奠定基础。

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用RT-PCR扩增了猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗株(C株)的E2蛋白主要抗原区(tE2)编码区,并定向克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组表达载体pPROEX-tE2,将其转化大肠杆菌DH5α菌株,经IPTG诱导,tE2蛋白获得高效表达;经检测,该重组蛋白能被CSFV C株抗血清识别。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了1株稳定分泌抗tE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经检测,该单克隆抗体能够与CSFV C株和石门株以及杆状病毒表达的重组E2蛋白发生特异性反应。推测,该单克隆抗体是针对CSFV E2蛋白的一个保守线性表位。

猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究

利用基因搭桥技术,在KlenowDNA聚合酶作用下,分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因,并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定,构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下,实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C、GST-D、GST-E),以GST亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。应用ELISA和Western-blot检测证实:E抗原表位基因表达的融合蛋白GST-E具有免疫学活性,而C和D的抗原表位基因虽然都表达了融合蛋白GST-C和GST-D,但未检测到免疫学活性。免疫攻毒保护试验表明:融合蛋白GST-E具有一定的免疫保护功能,为多表位疫苗的研究奠定了基础。

猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究

应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E(A),在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E(A),以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒(classical swinefever virus,CSFV)发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位集中区的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白抗原表位集中区原核重组目的蛋白,建立CSFV抗原和抗体快速检测方法。通过扩增CSFV E2蛋白抗原表位集中区基因,亚克隆至表达载pET-30a(+),构建重组原核表达载体pET-30a-E2-1,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示,出现与目的蛋白大小一致的蛋白条带,分子质量大小为31ku。对重组蛋白表达条件进行优化,最终获得其诱导表达的最佳温度为18℃,最佳IPTG浓度为0.1mmol/L。目的蛋白以包涵体形式存在,其表达量约占菌体总蛋白含量的46%。Western blot分析显示,目的蛋白不仅能与兔抗CSFV高免血清反应,还可以与载体特异性标签His单抗反应,表明融合蛋白具有良好的抗原性,为CSFV抗原和抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。

猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D),根据中和特性和保守性差异,将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区,A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本文采用pRSETC载体,对A抗原区2744nt～2947nt(791aa～858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达,并分析表达产物的免疫反应性。研究发现:EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合,且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明:A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达

目的:对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法:利用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a(+)载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol/L尿素(pH8.0)溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论:重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta(DE3),解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。

猪瘟病毒保护抗原E2和猪IgG重链基因的合成及其表达蛋白

根据已发表文献及DNAstar软件分析 ,选取双拷贝Shimen株猪瘟病毒E2基因A ,D区和猪IgG重链中可与SPA非特异性结合的区域作为目的基因进行串联表达。根据GenBank发表的序列 ,Primer5 0软件的辅助下分别设计三对引物 ,并在扩增第二条和第三条片段的上游引物 5′端分别设计一个长 5个氨基酸的Linker,将扩增的三片段串联克隆入原核表达载体pET 32a中 ,构建成重组质粒pET 2eh ,对重组质粒诱导表达 ,表达蛋白经纯化后标记于CowanⅠ株金黄色葡萄球菌SPA上 ,与收集的 80份待检血清进行平板凝集试验 ,结果与现有诊断试剂盒检测结果具有较好的符合性。该方法具有简单 ,快速 ,敏感 ,易于操作的特点。

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。