3种不同类型佐剂的猪瘟E2基因工程亚单位疫苗免疫效果的比较研究

为了筛选用于制备猪瘟E2基因工程亚单位疫苗的佐剂,用水佐剂、双相佐剂以及油包水佐剂分别制备了3种猪瘟E2基因工程亚单位疫苗,在猪上进行了免疫效果的评价。本试验选取4~5周龄猪瘟病毒病原、抗体阴性猪40头,随机分为8组,每组5头,其中3组用于3种不同佐剂制备的亚单位疫苗的单次免疫效果评价,3组用于疫苗的二次加强免疫效果评价,1组为商品化猪瘟活疫苗对照,1组为空白对照。免疫后进行临床观察、抗体水平监测和免疫效力评价,观察各组仔猪的不良反应情况。结果显示:3种不同类型佐剂制备的猪瘟E2基因工程亚单位疫苗接种猪后均无任何不良反应,均能诱导机体产生良好的中和抗体,油包水佐剂制备的疫苗与另外2种佐剂制备的疫苗相比,免疫空窗期短,免疫持续期长,中和抗体水平高,在临床使用上更具优势。本研究为商品化亚单位疫苗佐剂的选择提供了重要的数据支持。

猪瘟E2基因工程亚单位疫苗使用效果分析

猪瘟俗称"烂肠瘟",又称"猪霍乱",是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起,一年四季均可导致不同年龄、性别、品种的猪和野猪感染发病,具有高度传染性和致死性,在养猪生产中猪瘟的防控至关重要。猪瘟E2基因工程亚单位疫苗可以有效改善目前猪瘟的防控现状。从猪瘟E2基因工程亚单位疫苗免疫前后检测结果得出.

种猪繁育与育肥场猪瘟E2基因工程疫苗免疫效果的调查与研究

为探究猪瘟E2基因工程亚单位疫苗相比于传统猪瘟C株弱毒疫苗(脾淋源)在免疫与生产上的优势,本文以汉中某一地方品种种猪场和代养场为调查对象,选择一批繁育母猪和育肥仔猪分别免疫猪瘟E2基因工程亚单位疫苗和猪瘟活苗,对比结果发现,母猪免疫猪瘟E2亚单位疫苗后哺乳仔猪断奶成活率平均提高了16.3%;且接种的两种猪瘟疫苗对育肥仔猪的免疫效果差异极显著(P<0.01),其中E2亚单位疫苗相比于猪瘟活疫苗能够明显提高育肥仔猪抗体阻断率和降低离散度,有助于育肥仔猪的健康生长,这为规模化猪场在选择猪瘟疫苗时提供重要参考依据。

猪瘟E2亚单位疫苗研究进展

猪瘟是由猪瘟病毒引起的危害极大的一种传染病,具有高度的传染性和致死性,利用疫苗控制该病的流行是世界各国使用的广泛策略。E2亚单位疫苗具有安全性好、稳定性强的特点,且具有自然感染和接种疫苗的抗体差异,是未来新型疫苗研究的方向之一。本文综述了E2亚单位疫苗的保护效力、影响因素及未来发展方向。

中博生物PCV2基因工程亚单位疫苗强势来袭,首日签单1152万mL

2014年12月18日，在由湖北省畜牧兽陕学会、湖北省兽用生物制品工程技术研究中心共吲主办、武汉中博生物股份何限公州承办的猪圆环病毒防控国际学术研讨会上，武汉中博生物股份有限公司发布了新产品——猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗（CP08株）。来自韩国、美国和中国的专家以及中博生物的全国经销商近600人共同见证了这一辉煌时刻。

猪瘟E2亚单位疫苗攻毒保护效力研究

猪瘟E2亚单位疫苗是一种用杆状病毒载体系统表达的猪瘟病毒E2重组蛋白,与油佐剂按比例混合、乳化制成的新型灭活疫苗,可区分感染和接种疫苗动物,有助于猪场的猪瘟净化。为评价该疫苗免疫效力,本研究用猪瘟E2亚单位疫苗与猪瘟兔化弱毒疫苗(传代细胞源)分别免疫靶动物,二免后2 w用强毒人工感染试验动物,连续测温16 d,并记录试验猪临床症状,结合病理剖检、组织器官病毒含量测定结果,比较不同疫苗保护力。结果显示:对照组猪攻毒后体温高热稽留,表现出典型猪瘟症状,攻毒后11 d内5/5发病死亡,尸检剖检呈典型猪瘟病理解剖学变化;免疫猪全部健活,未表现任何猪瘟症状,组织器官剖检无病变。结果表明,猪瘟E2亚单位疫苗与活疫苗保护效力相当,可为靶动物提供可靠的免疫保护效力。

猪瘟E2亚单位疫苗和猪口蹄疫O型/A型二价灭活疫苗联合免疫的临床评价

在非洲猪瘟成为常态化的背景下,疫苗的联合使用可有效优化、重构猪群的免疫程序,在保证防控重大疫病的前提下,减少猪群免疫负担和应激,降低免疫苗时感染非洲猪瘟的风险。为此,本研究用猪瘟E2亚单位疫苗和猪口蹄疫O型/A型二价灭活疫苗在实验室进行混合,测试了其物理性状,并在田间进行了安全性、有效性的临床研究。研究结果表明,2种疫苗按不同比例混合后呈剂型与占比较大的疫苗剂型相同,黏度、通针性均优于猪瘟E2亚单位疫苗,在2~8℃保存7天后,疫苗均一、稳定,未见分层,离心后无水相析出;采用间隔免疫、同步分点注射、同步混合注射的方式免疫试验猪均未引起免疫副反应,同步混合注射的免疫效果优于其他试验组,但各组间差异不显著(P>0.05),未见免疫干扰现象。本研究证实猪瘟E2亚单位疫苗和猪口蹄疫O型/A型二价灭活疫苗可同步混合免疫,不仅安全有效,而且降低了猪群免疫负担和兽医免疫劳动强度,适合在临床中大面积推广应用。

猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫攻毒保护效力试验

为了评价猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫效果,本试验在试验猪场用猪瘟E2亚单位疫苗与猪瘟减毒活疫苗分别免疫供试猪,并定期测定猪瘟病毒抗体。饲养至24周龄时,每组随机选取5头运至检验动物房,用猪瘟石门系强毒进行人工感染。根据试验猪攻毒后临床症状、病理剖检和猪瘟抗原、抗体检测结果,比较分析了猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫保护力。结果显示,对照组的试验猪攻毒后12 d内全部死亡,并表现出典型的猪瘟症状和病理变化;免疫猪全部存活,未见猪瘟症状和肉眼可见的组织器官病变,血样的猪瘟抗原ELISA检测结果均为阴性。结果表明,猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫1次后,24周仍能为靶动物提供可靠的免疫保护效力,与猪瘟减毒活疫苗2次免疫的保护效力相当。

酵母表达典型猪瘟E2亚单位疫苗对致死量攻毒提供保护

典型猪瘟（CSF）由典型猪瘟病毒（CSFV）引起，是一个高度传染的猪病，给猪业生产造成巨大的经济损失。病毒衣壳糖蛋白E（ms）和E2是感染该病毒后诱导产生CSFV抗体的主要靶向目标。毕赤酵母表达E2蛋白（yE2）可产生免疫保护．对抗CSFV攻毒。

甲醛灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的最佳条件研究

为探究甲醛对猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液最佳的灭活条件,本试验采用10%的甲醛溶液与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液混匀,使甲醛终浓度分别达到0.05%、0.07%、0.10%、0.15%、0.20%,在4~8℃下经过不同时间的灭活,通过对灭活液不同时间点的无菌检验及灭活检验,综合判定灭活效果。结果显示:猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液在甲醛终浓度为0.07%时灭活72h,或甲醛终浓度为0.10%和0.15%时灭活60h,或甲醛终浓度为0.20%时灭活48h,均取得可靠的灭活效果。考虑到甲醛的毒副作用,笔者认为4~8℃下用0.07%甲醛终浓度灭活72h是比较理想的灭活条件。

2种佐剂在猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗中的效果比较

为给猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗选择一种理想的佐剂,以增强机体对抗原的适应性免疫应答,协同提高动物免疫力。实验用水包油Merckinade SDA 25佐剂和双向Montanide ISA 206佐剂,分别按各自说明制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗,再对两种佐剂的疫苗进行稳定性、黏度、安全及效力检验,比较评价出猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的理想佐剂。结果表明,两种佐剂疫苗的稳定性、黏度、安全均合格,无明显差异;但Montanide ISA 206佐剂疫苗较Merckinade SDA 25佐剂疫苗诱导抗体效价更高。据此,笔者认为,Montanide ISA 206佐剂是猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗比较理想的佐剂。

猪瘟流行毒E2基因部分编码序列的分析与比较

利用RT-PCR方法获得16个猪瘟流行毒株、5株弱毒疫苗株和外来的4株猪瘟E2基因部分编码序列的扩增片断,并对其进行测序,获得659bp含E2基因N段A、B、C、D四区域的编码序列。利用DNAstar软件对其中616bp的片段进行序列分析,并与Genebank中的Alfort﹑Brescia﹑HCLV﹑Shimen等毒株进行比较,结果20株病毒所测序列均为猪瘟E2基因序列,所有毒株碱基替换随机分布于整个序列,部分毒株出现碱基缺失现象。序列分析结果表明近期流行的毒株不仅与50年代流行的Shimen株、现用的疫苗株距离较远,而且流行毒株呈不同亚群方向演变。本研究所测的20株流行株E2基因N端6个与C端的2个半胱氨酸(Cys)均未发生变异,但其他位点的核甘酸变异与缺失,引起各区的抗原表位呈现不同程度的变异。

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因 ,并将其克隆到 pMD 18 T载体 ;经转化、筛选、鉴定后 ,测定了核苷酸序列 ,根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行 gp5 5氨基酸序列推导 ,并进行同源性比较。结果表明 ,该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为 81.9%、83.4 %和83.5 % ;相应地 ,gp5 5氨基酸同源性分别为 94 .8%、95 .6 %和 95 .3%。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacHTb后获得了重组质粒 pFBHT E2 ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,发生转座作用 ;经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA ,将其命名为rBacmid E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。

猪瘟病毒基因组及基因工程疫苗研究进展

本文着重介绍了猪瘟病毒基因组结构组成、基因组产物和以基因组为研究对象开展的亚单位疫苗、活载体疫苗、标记疫苗等新型基因工程疫苗的研究现状。

猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用

为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用,将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备猪瘟E2、E0重组蛋白,Western blot检测蛋白表达和糖基化情况。用重组蛋白单独或联合免疫家兔,检测血清中抗体水平变化。在首免后4周用猪瘟兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔,监测其体温变化,并运用RT-PCR检测家兔脾脏中病毒RNA。结果表明,E2、E2+E0免疫组兔均可诱导产生高水平的抗体和中和抗体,但两组间差异不显著。攻毒后E2免疫组2/5兔出现轻热症状,1/5兔脾脏病毒阳性;E2+E0组兔均未出现发热症状,也未检测到C株病毒RNA。E0组不能诱导兔产生中和抗体,但也能提供部分保护(2/5)。可见,基于E2、E0的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,且两者联合使用具有协同作用,有望成为新型亚单位疫苗的候选抗原。

猪瘟重组蛋白E2的兔体免疫保护试验

鉴于猪瘟病毒不能使家兔发病,但能使之产生免疫原性,而且猪瘟兔化弱度苗能在兔体的定型热反应。本研究选用家兔为试验模型,将自制的亚单位疫苗用弗氏佐剂乳化后免疫家兔,持续一定的免疫周期后,用猪瘟活疫苗(II)攻击免疫及对照试验家兔。根据T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA及攻毒保护试验对所制备的抗原进行了全面的评价。结果表明,该免疫原具有良好的免疫原性,而且能保护免疫家兔为4/4。可以进行下一步的开发和利用价值。以期该疫苗能为猪瘟的防治做出贡献。

武汉中博基因工程圆环苗拟12月上市

日前，据武汉中博生物股份有限公司相关负责人介绍，12月下旬，武汉中博猪圆环病毒2型ORF基因工程亚单位疫苗将在全国正式上市。据悉，武汉中博自2009年便与美国普泰克公司、纽博特公司正式开展技术合作。研发新型的猪圆环病毒2型基因工程疫苗并取得成功，成为国内首家攻克基因工程圆环疫苗的企业。

产气荚膜梭菌β2蛋白的高效可溶性表达与基因工程亚单位疫苗的制备

β2毒素是一种新近报道的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）毒素,A、B、C、D、E等5个型的梭菌均可产生,该毒素也是制备基因工程亚单位疫苗的主要研究对象。本研究通过优化β2蛋白的密码子、去除蛋白信号肽,选择亲水性与抗原性较好的序列,同时优化表达条件等方法的探索,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达的可溶性重组β2蛋白,用该蛋白免疫小鼠可使动物产生较高的血清抗体水平,针对A型、B型、C型和D型产气荚膜梭菌的保护率分别为90%、100%、80%和90%,小鼠三免后第7~14天抗体效价达到峰值。本研究表达的β2蛋白具有较好的免疫原性,可进一步用于研制预防产气荚膜梭菌的基因工程亚单位疫苗。

不同猪瘟疫苗母源抗体持续期及半衰期研究

为研究猪瘟E2亚单位疫苗与猪瘟活疫苗母源抗体衰减规律及其差异,合理制定仔猪的免疫程序,用60头母猪及其所产仔猪分别免疫两种疫苗,跟踪监测免疫试验母猪抗体及其所产仔猪的母源抗体持续期。结果表明,免疫不同疫苗的母猪猪瘟抗体差异显著(P<0.05),E2亚单位疫苗组受自身抗体干扰小,免疫后猪瘟抗体水平最高,阻断率均值为91.62%,中和抗体均值为11.4log2;E2亚单位疫苗组仔猪的母源抗体持续期可达70 d,兔化弱毒疫苗组为28 d;E2组断奶仔猪母源抗体半衰期为10.5 d,兔化弱毒疫苗组为7.5 d。母猪猪瘟抗体与仔猪母源抗体呈显著正相关(R^2=0.96)。本研究表明,猪瘟E2亚单位疫苗免疫母猪后,受自身抗体干扰小,能产生高水平猪瘟抗体,并且其所产仔猪的母源抗体持续期可达70 d,即仔猪首免日龄暂定为70日龄,可有效减轻仔猪早期疫苗免疫负担,为育肥猪免疫一针猪瘟疫苗出栏奠定了试验基础。

高效制备霍乱弧菌菌影及其增强猪瘟疫苗免疫效果的研究

为评价霍乱弧菌菌影(VCG)对猪瘟活疫苗及猪瘟病毒E2蛋白抗原区(BC和AD区)亚单位疫苗免疫增强效果的作用,本实验首先利用含有裂解质粒的霍乱弧菌制备VCG,通过对细菌裂解前后进行平板计数及透射电镜检测VCG裂解效果,结果显示所制备的VCG裂解率高,且基本形成一个完整的细菌空壳。在确定最佳猪瘟活疫苗使用量后探究VCG对猪瘟活疫苗(CFS ST)免疫效果的影响,实验分别用VCG+CFS ST和CFS ST免疫家兔一次,设置对照组,并在免疫第42 d后攻毒。本研究还探究了VCG作为佐剂对猪瘟E2蛋白主要抗原区蛋白亚单位疫苗免疫效果的影响,实验分别用完全弗氏佐剂(CFA)和VCG联合E2蛋白主要抗原区蛋白,通过间隔两周的方式分4次免疫家兔,设置对照组,并在免疫第56 d后攻毒。通过阻断ELISA方法每周检测家兔血清的抗体阻断率,免疫后以500 RID50的猪瘟病毒弱毒株通过耳缘静脉注射方式对家兔攻毒。结果显示,50 RID50的猪瘟活疫苗组家兔血清抗体阻断率显著降低(p<0.001);VCG+CFS ST组家兔猪瘟抗体阻断率在免疫14 d后大部分时间点显著高于CFS ST组(p<0.05),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应;CFA(E2)组和VCG(E2)组的家兔猪瘟抗体阻断率均显著达到较高水平(p<0.001),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应。以上结果表明VCG可作为免疫佐剂增强猪瘟活疫苗的免疫效果;VCG联合猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区亚单位疫苗在家兔中也具有较好的免疫效果。本研究为研发廉价高效的疫苗佐剂提供重要的实验依据。