CpG序列和猪白细胞介素6基因转染表达对猪囊尾蚴基因疫苗免疫影响的研究

以猪囊尾蚴VTS76抗原基因和质粒VPIL 6、pUCl8 CpG免疫接种小鼠 ,检测了小鼠的体液及细胞免疫反应。结果发现 ,VPIL 6或pUC CpG与VTS76共同免疫小鼠的特异性抗体滴度、IgG含量、淋巴细胞白细胞介素 2诱生活性、脾细胞增殖反应和血液免疫细胞数量显著高于VTS76免疫组和对照组。证明VPIL 6和CpG序列能显著增强动物对DNA疫苗的细胞和体液免疫反应 。

猪白细胞介素2与融合白细胞介素4/6基因共表达的免疫效应研究

目的构建猪融合白细胞介素4/6与猪白细胞介素2基因的共表达载体,研究其共表达对小鼠免疫的协同效应。方法以2A自剪接技术首次构建猪融合白细胞介素4/6与白细胞介素2基因的共表达重组质粒,以壳聚糖纳米材料包裹制成纳米颗粒,进行体外转染HEK293细胞,提取总RNA进行RT-PCR分析,最后肌肉注射小鼠进行体内实验并分析。结果成功构建了重组共表达质粒VRIL4/6-2;壳聚糖包裹后转染HEK293细胞,48 h后收集细胞,RT-PCR检测显示目的基因能够在HEK293细胞中高效地转录与表达。小鼠接种实验结果表明,实验组血清中的IgG和IgG2a的含量比对照组显著增加,并且VRIL4/6-2-CS接种组的小鼠体液免疫水平明显增高(P<0.05);VRIL4/6-2实验组的CD4+淋巴细胞显著多于其它实验组(P<0.05);实验组IL-2、IL-4、IL-6、IL-23基因的表达水平明显高于对照组(P<0.05),实验组小鼠外周血白细胞、血小板和血红蛋白的含量均显著高于对照组(P<0.05)。结论 VRIL4/6-2共表达质粒能够更好的增强动物体液免疫和细胞免疫机能,可作为提高动物体液免疫和细胞免疫的经济高效安全新型免疫调节剂,具有潜在的重要应用前景。

猪霍乱沙门菌SC500运载TGEVS与猪IL-15融合基因疫苗的稳定性及免疫安全性

为研究猪霍乱沙门菌SC500作为TGEV S与IL-15融合基因疫苗pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15运载体的稳定性与免疫安全性,将外源表达质粒pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15及空载体质粒pCC-neo、pCI-neo转化SC500,采用体外增殖试验研究不同质粒在SC500中的稳定性,携带质粒的SC500对ST细胞的黏附率、侵袭力和增殖能力的影响;采用BALB/c小鼠口服免疫试验研究表达质粒在体内的稳定性及SC500对小鼠的安全性。结果显示:外源目的基因影响表达载体在运载体内的稳定性,就载体类型而言,对pCI-neo的影响大于对pCC-neo的影响;携带目的基因的外源质粒影响SC500对ST细胞的黏附率和侵袭率,pCC-neo影响大于pCI-neo;外源质粒影响SC500在小鼠体内的增殖能力,pCC-neo影响大于pCI-neo;SC500在体内的增殖中,其所运载的质粒具有一定的稳定性。结果表明,利用SC500运载基因疫苗pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15免疫小鼠具有相对的稳定性和免疫安全性。

改组猪IL-2基因与CpG序列对猪伪狂犬病灭活疫苗免疫应答的影响

将改组的猪白细胞介素-2基因(VRIL2S)与重组CpG(VR1C)质粒经离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒(CNP)包裹后(CNP-VRIL2S-VR1C),肌肉注射给已接种猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫猪,接种后第7、14、28、42和56d采集静脉血检测猪的免疫应答变化,并测定血清免疫球蛋白和白细胞介素含量。结果显示,接种组猪血清中IL-2、IL-6、IL-4以及特异性抗体和免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的含量显著高于空质粒疫苗对照组,同时外周血液的淋巴细胞和单核细胞数量也较对照组显著增加(P<0.05)。结果表明,CNP-VRIL2S-VR1C能持久显著提高猪对伪狂犬病灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫水平,具有被研制为高效安全的分子免疫增强剂的潜力。

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ+SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接正确。之后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为33 ku处出现了预期的目的蛋白。用8 mol/L脲对表达产物变性,经Ni2+-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。Western-blot分析证实,纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。

荣昌猪白细胞介素-2受体γ链基因克隆、表达与鉴定

运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽。荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%。运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp。将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coliBL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一条特异性的带;对γ诱导重组菌进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段。

猪白细胞介素4/6与牛融合抗菌肽共表达重组毕赤酵母的构建及其对小鼠的免疫协同效应

以2A自剪接技术构建猪白细胞介素4／6与牛融合抗菌肽（FBC）共表达重组毕赤酵母，为研究重组酵母对小鼠体内外的免疫协同效应，首先采用猪淋巴细胞增殖试验和抑菌试验研究重组毕赤酵母的体外生物学活性；再以发酵的重组酵母菌液进行小鼠灌胃试验，在试验的28d用致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行腹腔攻毒，每周采血检测小鼠的生长和免疫功能变化。体外试验结果显示，试验组比对照组显著刺激猪淋巴细胞增殖；明显抑制大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、金黄色葡萄球菌标准菌和金黄色葡萄球菌耐药菌的生长（P〈0．05）。小鼠灌胃试验结果表明，试验组小鼠外周血的白细胞、Th和Tc细胞含量显著多于对照组；试验组tlrs（tlr-1，4，6，9），il-1，il2，il-4，il-6，il-7，il-15，il-23和cd62l基因的表达明显高于对照组；试验组血清中的IgG、IgGl和IgG2a的含量比对照组显著增加。此外，试验组小鼠的体质量比对照组明显增加。攻毒后试验组80％的小鼠存活，而对照组小鼠则有明显的炎症及临床症状，最后全部死于感染，这表明试验组的存活率显著高于对照组（P〈0．05）。白细胞介素4／6与牛融合抗菌肽共表达重组毕赤酵母能够有效提高小鼠免疫功能，为探索研制增强动物免疫机能的安全高效的免疫调节剂提供新途径。