猪白细胞介素-2基因的克隆及其重组禽痘病毒载体的构建

采用RT-PCR技术自豫南黑猪脾淋巴细胞中扩增猪IL-2基因(pIL-2),RT-PCR产物进行T-A克隆并测序,获得了猪IL-2基因序列。将BamHⅠ酶切的猪IL-2基因非定向克隆到BamHⅠ酶切并去磷酸化的pSY538载体上,通过PCR、酶切和测序鉴定,筛选正向插入的重组质粒pSY538/pIL-2。NotⅠ酶切pSY538/pIL-2后,得到含有双启动子LP2和EP2的猪IL-2基因片段,将其亚克隆到含有LacZ基因的pSY681载体上,筛选正向插入的重组禽痘病毒转移质粒pSY681/pIL-2。测序结果表明,克隆的豫南黑猪IL-2基因长482 bp,包含1个完整读码框(465 bp),与GenBank中其他5条猪IL-2基因核苷酸同源性为99.9%。重组质粒pSY681/pIL-2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。成功构建了重组禽痘病毒转移质粒pSY681/pIL-2,为猪IL-2生物学功能的进一步研究和开发奠定基础。

猪白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达及其生物学活性测定

【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。

猪白细胞介素-2和融合抗菌肽重组酵母菌构建及其对小鼠免疫和生长的协同效应

为了开发经济实用的新型免疫调节剂,以2A自剪切技术构建重组毕赤酵母Pichiapastoris共同表达猪白细胞介素-2(IL-2)和融合抗菌肽基因,然后以重组基因工程酵母菌饲喂ICR小鼠,以实时荧光定量PCR、ELISA和流式细胞计数评估其对小鼠免疫力和生长的影响。实验结果显示,处理组(融合抗菌肽重组酵母菌、IL-2和融合抗菌肽重组酵母菌)小鼠的生长明显优于对照组(空质粒酵母菌)(P <0. 05),且血清Ig G、Ig G1和Ig G2a含量显著升高(P <0. 05); TLR1、TLR4、TLR6、TLR9、IL-7、IL-15、IL-23、CD62L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、CRP4和CAMP基因的表达水平显著增加(P <0. 05)。同时,处理组小鼠血液白细胞Th和Tc细胞明显增多(P <0. 05),免疫力和存活率均明显高于对照组(P <0. 05)。重组酵母菌能有效增强小鼠的先天和获得性免疫力,促进生长,可进一步开发成安全有效的免疫调节生物制剂,改善动物的生长和免疫力。

荣昌猪白细胞介素-2受体γ链基因克隆、表达与鉴定

运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽。荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%。运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp。将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coliBL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一条特异性的带;对γ诱导重组菌进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段。

猪IL-2与IL-6的融合表达及其产物的促淋巴细胞增殖活性

为了获得具有猪白细胞介素-2(pIL-2)和猪白细胞介素-6(pIL-6)双重活性的融合蛋白,研究其作为高效免疫佐剂的可行性,作者利用基因重组技术将克隆到的pIL-2和pIL-6基因的成熟肽片段利用一段柔性Linker序列串联,然后插入到原核表达载体pBV220的适当位置,获得重组质粒pBVpIL-6-2,转化E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3)后,42℃诱导表达得到相对分子质量约为36.7ku的重组蛋白pIL-6-2,对蛋白进行纯化、复性后用MTT法检测其对小鼠脾淋巴细胞的促增殖活性,结果显示不同浓度的pIL-6-2蛋白对小鼠脾淋巴细胞的促增殖活性差异很大,其中以0.1μg·mL-1浓度的pIL-6-2活性最好。本研究为利用该蛋白作为高效免疫制剂的应用奠定了良好的基础。

猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列设计1对引物,将猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-TEasy载体上并测序。测序结果显示,克隆的猪IL-2 cDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465 bp,编码154个氨基酸,相对分子质量为17 400,等电点为5.27,此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%,与猫、牛、鸡、犬、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%、82.6%、28.2%、80.6%、29.6%、83.4%、81.3%、82.0%和61.5%。将此IL-2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual后获得了重组质粒pFBD-IL2,进而转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到了含猪IL-2基因的重组DNA,将其命名为Bacmid-IL2。本试验为进一步在昆虫细胞中表达猪IL-2基因、开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。

改组猪IL-2基因与CpG序列对猪伪狂犬病灭活疫苗免疫应答的影响

将改组的猪白细胞介素-2基因(VRIL2S)与重组CpG(VR1C)质粒经离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒(CNP)包裹后(CNP-VRIL2S-VR1C),肌肉注射给已接种猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫猪,接种后第7、14、28、42和56d采集静脉血检测猪的免疫应答变化,并测定血清免疫球蛋白和白细胞介素含量。结果显示,接种组猪血清中IL-2、IL-6、IL-4以及特异性抗体和免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的含量显著高于空质粒疫苗对照组,同时外周血液的淋巴细胞和单核细胞数量也较对照组显著增加(P<0.05)。结果表明,CNP-VRIL2S-VR1C能持久显著提高猪对伪狂犬病灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫水平,具有被研制为高效安全的分子免疫增强剂的潜力。

重组猪α干扰素-白细胞介素-2复合蛋白在猪体内抗高致病性PRRSV活性的研究

为了评价猪α干扰素-白细胞介素-2重组复合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)在猪体内抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP PRRSV)的效果,采用重组猪α干扰素(rPoIFN-α)-重组猪白细胞介素-2(rPoIL-2)等量混合物、单一rPoIFN-α蛋白、单一rPoIL-2蛋白、rPoIFN-α-linker-PoIL-2复合蛋白等以注射方式进行HP PRRSV的攻毒保护试验,通过分析试验猪体温变化、HP PRRS典型症状维持时间、死亡率、月增重率、病毒血症维持时间等指标,采用RT-PCR和间接ELISA检测攻毒后带毒及抗体产生情况,以评价这些制剂对攻毒猪的保护效果。结果显示,rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白、rPoIFN-α-rPoIL-2蛋白等量混合物、rPoIFN-α蛋白均可有效抑制HP PRRSV在猪体内的增殖和持续性感染,明显降低发病猪体温,缩短HP PRRS典型症状维持时间,减缓发病症状,降低死亡率;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白对HP PRRSV的抑制作用优于单一rPoIFN-α蛋白,稍优于rPoIFN-α-rPoIL-2蛋白等量混合物,显著优于单一rPoIL-2蛋白。上述结果为进一步选取以rPoIFN-α-linker-PoIL-2复合蛋白为主要成分的猪基因工程复合抗病毒制剂研究奠定了基础。

猪IL-2成熟蛋白在昆虫细胞中的表达及生物学活性鉴定

以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增猪IL-2成熟蛋白基因。将猪IL-2成熟蛋白基因定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2,转染昆虫细胞。间接免疫荧光试验表明重组猪IL-2在Sf9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为20000的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,重组猪IL-2经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,重组猪IL-2在昆虫细胞中得到表达,表达的重组蛋白具有一定生物学活性,为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。