猪白血病抑制因子的真核表达与活性分析

采用分子克隆技术构建猪白血病抑制因子(LIF)的真核表达载体,表达重组猪LIF蛋白并分析其活性。酶切和DNA测序显示,所构建的真核表达质粒pcDNA3.1-pLIF-MycHis含有编码分泌型猪LIF蛋白的cD-NA序列;免疫印迹分析显示,分泌到上清中的重组蛋白在相对分子质量约37 000的位置上有明显的增强表达条带;活性分析结果显示,重组蛋白能够维持小鼠E-14胚胎干细胞在未分化状态。该结果显示重组猪LIF蛋白在CHO细胞中进行了正确表达并具有很好的生物活性,能够用来培养小鼠胚胎干细胞,为用于猪胚胎干细胞系的研究奠定了良好的基础。

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(i PS细胞)。方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体p CAG-p LIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-p LIF细胞)。通过RT-PCR、q PCR、Western blot等方法检测STO-p LIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-p LIF细胞作为饲养层,培养大鼠i PS细胞。通过生长曲线检测、碱性磷酸酶染色、干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-p LIF细胞饲养层在大鼠i PS细胞培养方面的功能。结果:STO-p LIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠i PS细胞在形态、多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠i PS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠i PS存在差异(P<0.05)。结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-p LIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠i PS细胞培养中具有一定优势。

建立高效表达猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系

该文目的是建立高效表达重组猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)系PEF-p LIF,为下一步辅助建立和培养猪nave胚胎干细胞奠定基础。以猪胚胎成纤维细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR的方法扩增猪白血病抑制因子基因(LIF),将LIF c DNA连接到真核表达载体p CAGDNA3的启动子下游,构建LIF基因真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;利用核转染的方法将p CAGDNA3-p LIF质粒转入PEF;对转染细胞进行G418筛选,得到稳定高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;利用RT-PCR、Western blot鉴定PEF-p LIF中LIF基因及LIF表达情况;使用PEF-p LIF细胞作为饲养层培养小鼠胚胎干细胞,通过对小鼠胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色及细胞免疫荧光染色,对PEF-p LIF维持干细胞干性功能进行初步验证。实验结果显示,成功构建了真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;并将其成功转入PEF中,获得高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;以PEF-p LIF作为饲养层成功培养克隆形态正常的小鼠胚胎干细胞。该研究表明,稳定高效表达重组猪LIF蛋白的猪胚胎成纤维细胞系PEF-p LIF可作为饲养层维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态,可为下一步建立及培养猪nave胚胎干细胞提供条件。