ACE2对猪流行性腹泻病毒体外感染传代猪小肠上皮细胞的影响

为探究血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染仔猪过程中发挥的作用,本研究通过转录组学分析仔猪肠道ACE2在PEDV感染前后表达的变化情况,然后利用猪小肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cells, IPEC-J2细胞)模型,通过RT-qPCR、Western blot检测PEDV感染后ACE2的mRNA、蛋白表达水平的变化。过表达与抑制表达ACE2后通过RT-qPCR、Western blot、TCID50检测PEDV复制水平。结果显示,PEDV感染IPEC-J2后ACE2的mRNA及蛋白表达水平均显著下调,与转录组学结果一致。过表达ACE2组PEDV感染量显著上升,抑制表达ACE2组PEDV感染量显著下降。本研究在细胞水平上验证了ACE2在PEDV感染过程中的作用,即PEDV感染能够使ACE2表达量下降,在IPEC-J2细胞中过表达ACE2能提高PEDV复制水平,抑制ACE2的表达可降低PEDV复制水平。

永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

乳酸锌对猪空肠上皮细胞IPEC-J2增殖及相关调控基因mRNA表达的影响

旨在探讨乳酸锌对猪空肠上皮细胞增殖及相关调控基因ZnT2、DMT1、IREG-1、MT1和ZIP4mRNA表达的影响。用乳酸锌的锌浓度分别为50、100、150、200mg.L-1的培养基培养IPEC-J2细胞,采用比色法测定分析细胞增殖变化;用实时荧光定量RT-PCR方法检测ZnT2、DMT1、IREG-1、MT1及ZIP4mRNA表达,以TBPmRNA的表达水平作为内参对照。在细胞培养前36h,乳酸锌对IPEC-J2细胞基本没有影响,随锌浓度递增细胞增殖幅度升高;乳酸锌处理IPEC-J2细胞后,ZnT2、DMT1、IREG-1及MT1mRNA表达随锌浓度增高而升高,ZIP4mRNA表达则随锌浓度增高而降低。添加乳酸锌可以促进IPEC-J2细胞增殖,上调ZnT2、DMT1、IREG-1、MT1mRNA表达,下调ZIP4mRNA表达。

黄芩苷酯化物缓解H_(2)O_(2)诱导的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)氧化应激反应的研究

试验旨在探讨黄芩苷酯化物(BE)对H_(2)O_(2)诱导的IPEC-J2细胞氧化应激的缓解作用及其分子机制。采用CCK-8法检测细胞活性筛选出黄芩苷酯化物的适用浓度;采用ELISA法检测细胞中活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量;采用qPCR法检测细胞中HO-1和NQO-1 mRNA的表达量;采用WB法检测胞浆Nrf2蛋白、胞核Nrf2蛋白和HO-1的蛋白表达水平;免疫荧光法检测Nrf2蛋白入核情况。结果显示,BE的适用浓度为10、20、40 mmol/L;与对照组相比,H_(2)O_(2)组中ROS、MDA含量显著升高(P<0.05);SOD、CAT活性显著下降(P<0.05);胞浆Nrf2蛋白与胞核Nrf2蛋白表达量显著升高(P<0.05);HO-1 mRNA的表达量显著升高(P<0.05);NQO-1 mRNA(P<0.05)表达量显著降低。与H_(2)O_(2)组相比,中、高剂量BE显著降低ROS、MDA含量(P<0.05);低、中、高剂量BE显著提高SOD、CAT活性(P<0.05);中剂量BE显著升高胞浆Nrf2蛋白的表达(P<0.05);低、中、高剂量BE显著升高胞核Nrf2蛋白的表达(P<0.05);中、高剂量BE显著升高HO-1 mRNA的表达量(P<0.05),低、中、高剂量均可显著升高HO-1蛋白表达;低、中、高剂量BE显著升高NQO-1 mRNA表达量(P<0.05)。研究表明,BE可以通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。

T-2毒素激活活性氧/核转录因子-κB信号通路诱导猪空肠上皮细胞发生炎性反应

本试验以猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型细胞,探讨T-2毒素诱导IPEC-J2炎性反应的影响及相关作用机制。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞活力,选择适宜的T-2毒素和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)浓度。试验分为4个组,分别为对照组、NAC组(4.0 mmol/L NAC)、T-2组(4.0 ng/mL T-2毒素)和T-2+NAC组(4.0 ng/mL T-2毒素+4.0 mmol/L NAC),处理12 h后测定各组IPEC-J2中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性、活性氧(ROS)水平、细胞炎症相关基因和核转录因子-κB(NF-κB)的相对表达量。结果表明:1)与对照组相比,T-2组IPEC-J2中CAT、T-SOD活性极显著降低(P<0.01),IPEC-J2中MDA含量和ROS水平极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比,T-2+NAC组IPEC-J2中CAT和T-SOD活性极显著升高(P<0.01),IPEC-J2中MDA含量和ROS水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。2)与对照组相比,T-2组IPEC-J2中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(P<0.05)、白细胞介素-6(IL-6)(P<0.01)、白细胞介素-10(IL-10)(P>0.05)的mRNA相对表达量升高。3)与对照组相比,T-2组IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比,T-2+NAC组IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。由此可见,T-2毒素通过诱导IPEC-J2产生过量的ROS,促进炎症相关基因及NF-κB蛋白的表达,导致IPEC-J2发生炎性反应。

壳寡糖对脂多糖诱导猪空肠上皮细胞氧化损伤的作用

本试验旨在通过脂多糖(LPS)诱导猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)来建立氧化应激模型,探讨壳寡糖(COS)的抗氧化作用效果。采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS和COS对IPEC-J2作用12、24、48 h后细胞增殖活性的变化;选择适宜浓度LPS(1.0μg/m L)和COS(200μg/m L)作用于IPEC-J2,分为对照组、LPS组、COS组、LPS+COS组。采用Western Blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)的含量。结果表明:1.0μg/m L的LPS对IPEC-J2作用24 h,细胞增殖的抑制率为41.6%,为造模的最适浓度和作用时间;COS在一定浓度范围内对IPEC-J2有增殖作用,其浓度为200μg/m L时效果最佳,作用时间为24 h时,细胞增殖率达到126.3%。LPS+COS组较对照组的SOD、CAT活性和M DA含量差异不显著(P>0.05),Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);LPS+COS组较LPS组的Nrf2蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),HO-1有升高趋势,但差异不显著(P>0.05),SOD、CAT活性显著升高(P<0.05),M DA含量显著降低(P<0.05)。由此可见,LPS诱导IPEC-J2氧化应激,而COS可进一步促进Nrf2和HO-1蛋白的高表达,并提高抗氧化酶的活性,降低氧化产物含量,从而增强细胞对氧化应激的抵抗力,起到保护作用。

苏氨酸对体外培养感染伪狂犬病毒猪空肠上皮细胞免疫相关基因表达的影响

本研究旨在探讨苏氨酸对体外培养感染伪狂犬病毒(PRV)猪空肠上皮细胞免疫相关基因表达的影响。试验选用IPEC-J2细胞为细胞模型,分为4个处理,对照组为未经PRV感染、苏氨酸浓度53.45 mg/L,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,均经PRV感染,苏氨酸浓度分别为53.45、106.90、160.35 mg/L,每组3个重复,每个重复4孔。37℃、5%CO2培养后1、6、12、24 h每组取1个重复采集细胞,用实时荧光定量PCR方法检测白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素15(IL-15)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA表达量。结果表明:1)PRV感染极显著降低了IL-1βmRNA表达量(P=0.001),苏氨酸水平(P=0.830)、时间与苏氨酸水平交互作用(P=0.249)的影响均不显著;2)PRV感染对IL-6 mRNA表达量影响不显著(P=0.162),随苏氨酸水平升高,IL-6 mRNA表达量极显著地先升高后降低(P=0.002),时间与苏氨酸水平交互作用的影响显著(P=0.012);3)PRV感染极显著提高了IL-15 mRNA表达量(P=0.000),提高苏氨酸水平极显著提高了IL-15 mRNA表达量(P=0.000),时间与苏氨酸水平交互作用的影响亦极显著(P=0.000);4)PRV感染极显著提高了TNF-αmRNA表达量(P=0.000),苏氨酸水平(P=0.113)、时间与苏氨酸水平交互作用(P=0.195)的影响均不显著;5)PRV感染极显著提高了TGF-β1 mRNA表达量(P=0.000),时间与苏氨酸水平交互作用的影响显著(P=0.015),苏氨酸水平的影响不显著(P=0.055)。结果提示,补充苏氨酸对感染PRV的IPEC-J2细胞先天性免疫功能具有分子表达水平的调控作用,总体上能够抑制IL-1β、TNF-α、TGF-β1基因表达,加强IL-6、IL-15基因表达,但影响具有时间效应。

不同浓度A2E对离体猪视网膜色素上皮细胞的影响

目的评价体外合成的A2E对猪视网膜色素上皮(RPE)细胞的细胞活力和生物学特性影响,为进一步研究A2E在RPE细胞相关疾病中的作用提供细胞模型。方法利用全反式视黄醛和乙醇胺体外合成脂褐质荧光基团A2E。不同浓度的A2E(0,50,75,100μmol/L)作用第3代体外培养的猪RPE细胞30,45,60,90min,换10%FBS DMEM-F12培养液孵育24h后,倒置荧光显微镜观察荧光强度,IPP6.0软件灰度扫描定量荧光强度。采用MTT法检测A2E作用细胞各个时间段的吸光度值,应用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析,评价A2E的细胞毒性及RPE细胞活性。结果A2E被RPE细胞摄取后主要分布于细胞核周围,具有自发荧光。MTT实验及荧光灰度扫描结果显示,不同浓度的A2E被细胞摄取后细胞活力和荧光灰度扫描结果不同,以50μmol/L浓度A2E作用RPE细胞60min时,细胞内荧光强度高同时细胞活力强。结论体外培养的猪RPE细胞摄取体外合成的50μmol/LA2E 60min后细胞对A2E的摄取较多,A2E对细胞的毒性相对较低,该条件下进行A2E对离体猪RPE细胞的研究较好。

TLR2/4、NOD1/2受体在ETEC感染猪肠道上皮细胞炎性反应中作用的研究

为探究Toll样受体2/4(TLR2/4)、核苷酸结合寡聚结构域样受体1/2(NOD1/2)在产肠毒素大肠杆菌(ETEC)诱导的猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)炎症反应中的作用,本研究以不同MOI(0.1、0.02、0.01)的ETEC感染IPEC-J2,2 h后,采用MTT法检测IPEC-J2的细胞活力,以筛选ETEC感染IPEC-J2的最适MOI。结果显示,经MOI 0.01的ETEC感染后IPEC-J2的细胞活力极显著低于对照组(P<0.001)。因此,采用最适MOI 0.01的ETEC感染IPEC-J2,分别培养不同时间后,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ETEC感染IPEC-J2中的TLR2/4、NOD1/2及促炎性细胞因子IL-6、IL-8、肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)mRNA的转录水平;利用TLR2/4混合抑制剂AMG9810及NOD1/2混合抑制剂NOD-IN-1分别与IPEC-J2共作用6 h,再经ETEC感染2 h后经qPCR检测TLR2/4、NOD1/2及下游促炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α m RNA的转录水平。q PCR结果显示,与对照组相比,ETEC感染的IPEC-J2中TLR2 m RNA转录水平(感染后30 min及120 min)及TLR4 m RNA转录水平(感染后105 min及120 min)均极显著升高(P<0.01、P<0.001),其余时间段与对照组无显著差异;IPEC-J2 NOD1 mRNA转录水平(感染60 min及以后)、NOD2 mRNA转录水平(感染后30 min~120 min)均极显著高于对照组(P<0.01、P<0.001),且IL-6、IL-8(感染后30 min除外)、TNF-α mRNA的转录水平随感染时间延长均极显著升高(P<0.01)。与不加抑制剂的感染组相比,经两种受体抑制剂作用后再感染ETEC的IPEC-J2中TLR2/4、NOD1/2 mRNA的转录水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下降;且其中的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的转录水平均极显著降低(P<0.01)。上述结果首次表明,ETEC感染可通过激活IPEC-J2受体TLR2/4、NOD1/2进而诱导下游促炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α mRNA转录水平的升高。本研究为阐释ETEC诱导猪肠道炎症反应的致病机制提供了参考依据。

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1 (ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1mRNA表达在4、12、24、48、72h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。

猪流行性腹泻病毒在稳定表达猪ACE2基因的IPEC-J2细胞中的增殖研究

为获得稳定表达猪源血管紧张素转换酶2(ACE2)的细胞株,用以增殖猪流行性腹泻病毒(PEDV)。构建了稳定表达猪源ACE2的猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2),并对PEDV在该细胞上的增殖进行了分析。将重组表达质粒pCMV3-porcine-ACE2-GFP转染至IPEC-J2细胞后,经潮霉素B筛选和单克隆细胞培养,获得IPEC-J2-ACE2细胞系。通过荧光定量RT-PCR和Western blot对单克隆细胞中ACE2基因的mRNA转录和蛋白表达水平进行鉴定。以PEDV-WH株感染IPEC-J2-ACE2细胞,通过间接免疫荧光试验和荧光定量RT-PCR检测发现,PEDV-WH株在IPEC-J2-ACE2细胞中比在IPEC-J2细胞中的增殖能力高。

复方参术对TGEV感染仔猪小肠黏膜上皮细胞凋亡因子Bcl-2/Bax的影响

探讨中药复方参术对感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的猪小肠粘膜上皮细胞(SIEC)中凋亡因子Bcl-2/Bax表达水平的影响。体外增殖TGEV,用TGEV感染SIEC为模型进行体外试验,试验分为复方参术组、空白对照组、模型组、苦参碱组,分别于加药后2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h,用荧光显微镜观察细胞凋亡情况,应用qRT-PCR和western blot检测Bcl-2与Bax表达水平。与空白对照组相比,模型组的SIEC发生了明显的细胞病变效应(CPE);与模型组比,复方参术组与苦参碱组细胞病变得到改善,复方参术组效果更加明显;与空白对照组相比,模型组Bcl-2 mRNA表达量极显著减少(P<0.01),复方参术组表达量增加极显著(P<0.01);与空白对照组相比,模型组Bax mRNA表达量极显著上调(P<0.01),复方参术组表达量减少(P<0.01)。这与Bcl-2/Bax蛋白表达水平检测到的结果一致。复方参术很可能通过上调SIEC Bcl-2 mRNA和蛋白的表达,下调Bax mRNA和蛋白的表达,从而抑制TGEV引起的SIEC凋亡。

猪圆环病毒2型感染猪肠上皮细胞对CD4^(+)T细胞分化关键分子mRNA的影响

[目的]探讨猪圆环病毒2型感染的猪肠上皮细胞对CD4^(+)T细胞分化关键分子mRNA的影响。[方法]利用免疫磁珠法分离猪外周血CD4^(+)T细胞,与猪圆环病毒2型感染48 h的猪肠上皮细胞共培养,收集共培养后72 h的T细胞,荧光定量PCR检测CD4^(+)T细胞分化关键分子变化。[结果]荧光定量PCR检测显示,细胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β1与转录因子T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3的mRNA水平均被显著下调,而IL-10的mRNA水平被显著上调。[结论]感染猪圆环病毒2型猪肠上皮细胞抑制CD4^(+)T细胞分化关键分子mRNA水平,提示CD4^(+)T细胞向Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、调节性T细胞分化被抑制,而IL-10的上调激活CD4^(+)T细胞向高分泌IL-10的CD4^(+)T细胞分化。

胰高血糖素样肽-2对脂多糖应激的IPEC-J2细胞形态和紧密连接相关基因表达的影响

本研究旨在考察胰高血糖素样肽-2(Glucagons-like peptide-2,GLP-2)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对仔猪空肠上皮细胞及其紧密连接(Tight Junctions,TJ)相关蛋白基因表达的影响,并探讨GLP-2调控仔猪肠道TJ蛋白基因表达可能的作用机理。试验一设对照、GLP-2、LPS、LPS+GLP-2共4个组,考查各处理对IPEC-J2细胞形态和紧密连接关键蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1基因表达的影响。结果:添加100nmol·L-1 GLP-2能显著改善IPEC-J2细胞形态,显著提高Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA表达(P<0.01);100μg·mL-1 LPS处理能显著破坏细胞形态、降低IPEC-J2细胞紧密连接蛋白mRNA的表达(P<0.01);在添加LPS基础上添加100nmol·L-1 GLP-2能有效维护细胞形态,显著增加IPEC-J2细胞TJ相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA的表达(P<0.01),增加量分别为46.3%、65.1%和30.3%。试验二考察了添加PI3K特异性抑制剂Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)阻断PI3K-Akt-mTOR信号转导途径后Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA表达量的变化,试验共设对照、GLP-2、GLP-2+Wort、GLP-2+LY等4个组。结果:添加抑制剂Wort后可显著降低IPEC-J2细胞Akt、mTOR、Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA的表达(P<0.01),降低量分别为46.9%、50.5%,38.1%、49.6%和18.9%;添加LY后上述mRNA的表达量分别显著降低了67.2%、70.8%,49.6%、60.9%和25.8%(P<0.01)。以上结果表明:添加GLP-2能够有效抑制LPS应激对IPEC-J2细胞形态和TJ相关基因表达的损伤,PI3K-Akt-mTOR信号转导途径可能是GLP-2调控肠道紧密连接蛋白基因表达的重要信号通路之一。

益生菌大肠杆菌Nissle 1917抗逆性能、猪肠上皮细胞黏附率及抑菌效果研究

本试验旨在研究益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Ec N)抗逆性能、猪肠上皮细胞黏附率及抑菌效果。采用体外法对Ec N进行生长曲线绘制和耐酸、耐胆盐、耐热性能的测定;以猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞为体外细胞模型,考察了Ec N对该细胞的黏附率以及对致病菌大肠杆菌K88的黏附抑制率;同时通过蛋白质印迹法检测了Ec N对IPEC-J2细胞β-防御素-2和Toll样受体4的水平的影响。结果表明:1)Ec N对高酸、高胆盐和高温环境具有一定耐受能力。2)Ec N对IPEC-J2细胞的黏附作用以对数期最佳,黏附率达33.96%,显著高于迟缓期、稳定期和衰亡期(P<0.05)。3)Ec N对致病菌大肠杆菌K88具有良好的抑制效果,黏附抑制率达87.84%。4)Ec N还能上调IPEC-J2细胞β-防御素-2和Toll样受体4水平。结果提示,益生菌Ec N具有较好的抗逆性能,能够良好地黏附猪肠上皮细胞,对致病菌大肠杆菌K88具有良好的抑制作用。

枯草芽孢杆菌对轮状病毒感染IPEC-J2细胞相关TLRs mRNA表达的影响

为研究枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是否通过激活猪肠上皮细胞(IPEC-J2)中Toll样受体(TLRs)的表达抑制轮状病毒(RV)的复制,本研究采用RV感染灭活B.subtilis预处理的IPEC-J2细胞,鉴定B.subtilis对RV在细胞中增殖的抑制作用,并检测不同时间点RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞中相关TLRs的表达。结果显示,RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞24 h后,与未处理细胞相比,其病毒的增殖能力显著被抑制。通过荧光定量PCR检测不同处理组细胞TLRs m RNA的表达水平,结果表明RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞在感染早期(1 h和3 h)与其他组相比,TLR2、TLR3、TLR9 m RNA表达均显著增加。本研究表明,灭活的B.subtilis能够抑制RV在IPEC-J2细胞中的增殖,并在病毒感染初期显著提高细胞TLRs m RNA表达,推测可能与调节宿主细胞的先天免疫反应有关。

谷氨酰胺对呕吐毒素诱导IPEC-J2细胞凋亡和炎症的影响

[目的]本试验以猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型,探讨谷氨酰胺(Gln)对呕吐毒素(DON)诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症的影响。[方法]通过MTT方法测定细胞活力来选择适宜的Gln浓度,以不添加Gln和DON的细胞为空白对照组,试验组分别为0.75 mmol·L^-1 Gln组,2.0μg·mL^-1 DON组和2.0μg·mL^-1 DON+0.75 mmol·L^-1 Gln组,处理24 h后测定各组细胞凋亡率、活性氧自由基(ROS)及细胞凋亡和炎症相关基因和蛋白的表达水平。[结果]与对照组相比,DON处理24 h细胞凋亡比例和ROS含量(ROS荧光密度/细胞总数)显著升高(P<0.01);与DON组相比,DON+Gln组显著降低细胞的凋亡比例和ROS含量(P<0.01)。与对照组相比,DON组上调IPEC-J2细胞白细胞介素1β(IL^-1β)、白细胞介素6(IL-6)、环氧合酶2(COX-2)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)炎症相关基因和Caspase-3及Caspase-8凋亡相关基因的表达水平;与DON组相比,DON+Gln组下调IPEC-J2细胞IL^-1β、COX-2、Caspase-3、Caspase-8、BAK和Bcl-2基因的表达水平。蛋白免疫荧光结果显示,与对照组相比,DON组上调IPEC-J2细胞Caspase-3,核转录因子κB(NF-κB)和磷酸化核转录因子κB(phospho-NF-κB)蛋白的表达,而添加Gln后(DON+Gln组)下调了相关蛋白的表达。[结论]Gln通过清除DON诱导的IPEC-J2细胞中过量的ROS及调节炎症和凋亡相关基因及蛋白的表达量来缓解由DON引起的肠道上皮细胞损伤。

感染产肠毒素大肠杆菌的猪小肠上皮细胞microRNA表达谱分析

试验旨在探索产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)诱导的microRNA(miRNA)表达谱变化,为解析宿主miRNA在ETEC感染过程中的调控作用提供理论基础。利用Illumina 6000 Novoseq SE50测序平台分别对ETEC感染前后的IPEC-J2进行高通量测序,用Bowtie与参考基因组比对,用DESeq R Package进行miRNA差异性分析。通过miRanda和RNAhybid共同预测差异表达miRNA的靶基因,对差异表达miRNA靶基因进行GO功能和KEGG通路分析。随机选取5个miRNAs,对测序结果进行实时荧光定量PCR验证。结果显示,IPEC-J2在感染前后的sRNA文库经过滤分别得到12889260和11203056条clean reads。感染前后文库中,miRNA所占比例最高,分别为73.16%和54.10%;分别有97.98%和69.83%长度为18~40 nt的sRNA可比对到参考基因组,表明测序质控良好。长度在22~24 nt的序列大部分首位碱基偏向U,2~8位点出现频率最高的碱基分别为AGCUUAU。共发现311个已知miRNAs,128个新miRNAs。在2个文库中,长度为23 nt的miRNA序列占比最高,分别为41.42%和23.56%。感染后共筛选到140个差异表达miRNAs,其中74个表达上调,66个表达下调。GO分析表明,miRNA靶基因显著富集于代谢过程、正向调节代谢过程、细胞成分或生物合成、免疫系统、细胞内部分和细胞器等功能。KEGG分析表明,差异表达miRNA靶基因显著富集于赖氨酸降解、生产IgA的肠道免疫网络、NF-κB信号通路和T细胞受体信号通路等。实时荧光定量PCR验证结果表明,随机选取的5个miRNAs表达趋势与测序结果一致,表明测序准确可靠。综上所述,IPEC-J2的miRNAs参与了ETEC感染过程,为进一步揭示调控ETEC感染的关键miRNA及其作用机制提供科学依据。

猪A3Z2基因生物信息学分析及其对PEDV复制的抑制作用

【目的】对猪源载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽蛋白3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide protein 3,APOBEC3,简称A3)家族的A3Z2基因进行克隆、生物信息学分析,筛选稳定表达A3Z2的IPEC-J2细胞,研究A3Z2对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)增殖的影响,以期为研究A3Z2的抗病毒功能奠定基础。【方法】以IPEC-J2细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增猪A3Z2基因CDS区,并对其进行遗传进化和生物信息学分析。构建pcDNA3.1-3×Flag-A3Z2载体,将其转染IPEC-J2细胞后经G418筛选、有限稀释法和单克隆细胞培养,获得稳定表达A3Z2的细胞株。分别采用间接免疫荧光试验和Western blotting方法鉴定A3Z2的表达,采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分析PEDV N基因的mRNA和蛋白表达水平。【结果】猪A3Z2基因CDS区长843 bp,编码280个氨基酸,分子质量约为32.7 ku,不存在跨膜区及信号肽切割位点,主要存在于细胞核中。A3Z2蛋白二级结构由α-螺旋(27.14%)、延伸链(17.86%)、β-转角(6.43%)和无规则卷曲(48.75%)构成。通过细胞筛选获得稳定表达A3Z2的细胞株IPEC-J2-A3Z2;间接免疫荧光方法和Western blotting结果显示,A3Z2能在IPEC-J2细胞中表达。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,细胞株IPEC-J2-A3Z2中PEDV N基因的mRNA和蛋白表达均被A3Z2抑制。【结论】本研究成功克隆了猪A3Z2基因,筛选获得了IPEC-J2-A3Z2细胞株,证实了A3Z2抑制PEDV复制的作用,为研究PEDV与A3Z2相互作用的分子机制和以此为靶点筛选抗PEDV新药提供了思路。

基于猪小肠上皮细胞炎症模型分析产肠毒素大肠杆菌诱导的转录组表达变化

【目的】分析产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)炎症反应的主要宿主调控基因及相关分子通路,为进一步揭示ETEC感染引发炎症反应的作用机制提供理论依据。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为100的ETEC菌液感染IPEC-J2细胞,18 h后收集细胞上清,通过ELISA方法检测炎性因子白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)的分泌水平。由Illumina PE150测序平台进行高通量转录组测序,通过edgeR v 3.12.1软件对测序结果进行差异表达分析,利用GOseq和KOBAS 2.0软件对得到的差异表达mRNA进行GO功能和KEGG通路富集分析,随机挑选5条差异表达mRNA,利用实时荧光定量PCR对其验证。【结果】试验成功建立了ETEC感染诱导的IPEC-J2细胞炎症模型。与对照组相比,炎症模型组共发现529条差异表达mRNA,其中236条表达上调,293条表达下调,包括HSP90AA1、CGNL1、CADPS2、EHBP1等免疫相关基因。GO功能分析表明,ETEC感染后差异表达mRNA显著富集于细胞组分和生物过程,包括细胞内成分(intracellular part)、细胞质(cytoplasm)、核成分(nuclear part)、胞内膜结合细胞器(intracellular membrance-bounded organelle)、膜结合细胞器(membrance-bounded orgabelle)及细胞进程(cellular process)等。KEGG通路分析表明,炎症模型中差异表达基因大多数被注释到疾病相关通路及Toll样受体信号通路、mTOR信号通路、细胞周期、黏附连接等免疫相关信号通路。利用实时荧光定量PCR验证随机挑选的5条差异表达mRNA,结果与测序报告中差异表达mRNA变化趋势一致,证明测序结果可信。【结论】HSP90AA1、CGNL1、CADPS2和EHBP1等基因可能在ETEC黏附IPEC-J2细胞并诱导炎症反应中发挥关键作用,并通过Toll样受体、mTOR等信号通路进行免疫调控。研究结果为进一步揭示ETEC感染诱导炎症反应的分子机制及相关调控网络提供参考依据。