猪繁殖与呼吸综合征病毒重组毒株GX-C4CG6致病性探究

为评估猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组毒株GX-C4CG6对小猪的致病性,选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的小猪进行攻毒试验,然后通过攻毒后猪只体温变化及死亡情况、临床症状评分、血清抗体变化、攻毒后平均日增重、解剖后肺脏眼观及显微病理变化、血清/肺脏病毒拷贝数等指标,对该毒株致病性进行评估。结果显示:GX-C4CG6毒株攻毒组有4头猪出现发烧,平均体温在攻毒后第12、13天大于40℃,最高体温达40.4℃,未出现死亡;被攻毒猪仅表现轻微减料,未表现出明显的呼吸障碍;攻毒后7 d,攻毒组猪只抗体开始转阳,至攻毒后14 d,攻毒组猪只ELISA抗体S/P平均值达最高;攻毒组在攻毒后第1周和对照组平均日增重差异不显著,至第2周差异显著(P<0.05),攻毒组显著低于对照组;被攻毒猪出现肺脏间质性肺炎,血清和肺脏病毒拷贝数浓度较高,分别达9.2×10^(5)和1.6×10^(7)copies/mL。结果表明,PRRSV GX-C4CG6毒株对小猪表现温和致病性。本研究为PRRSV重组毒株流行的控制提供了基础资料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株国家核酸标准物质的研制

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）美洲经典株国家核酸标准物质,将美洲经典株代表PRRSV VR2332接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、数字PCR法定值和临床试用。结果表明制备的标准物质的定值为（2. 06±0. 31）×104copies/μL;样品均匀;-20℃稳定保存12个月以上、4℃稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会评审,该制备物达到了国家二级标准物质的要求,可以作为核酸扩增检测的PRRSV美洲经典株核酸标准物质。

2013—2021年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查

【目的】调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。【方法】采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。【结果】检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现:高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。【结论】猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

猪繁殖与呼吸综合征流行特征与问题分析

猪繁殖与呼吸综合征又称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病为主要特征的急性接触性传染病。本文围绕猪繁殖与呼吸综合征流行病学特征,重点阐述了其病毒的变化趋势和典型临床表现,分析生产实践中的防控难点与对策,以期为广大养猪户预防和控制该病提供理论指导。

猪繁殖与呼吸综合征的流行、诊断与防制

1病原猪繁殖与呼吸综合征又被称为蓝耳病,主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种免疫抑制性传染性疾病。该病毒属于套式病毒目动脉炎病毒科,是一种正链RNA病毒,直径约为50~70纳米,有囊膜。猪繁殖与呼吸综合征病毒包括欧洲型和美洲型。因为病毒出现基因变异、病毒基因重组以及基因突变等,导致猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因变异较大,尤其是一些毒株的抗原性和毒力存在较大的差异。从当前我国发现的猪繁殖与呼吸综合征病毒的存在情况来看,主要为美洲型。

2016年～2017年我国华北地区某规模化猪场经典美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为了解近期我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及变异情况,本研究对该地区某猪场采集33份2016年~2017年疑似患PRRS猪病料样品进行PCR检测,对阳性样品进行病毒分离,并从分离株中选择两株病毒(SD158和SD192)进行全基因的序列扩增及分析。结果显示,检测到13份PRRSV阳性病料样品,病原为经典美洲型PRRSV,但仅分离到11株病毒(4株感染MARC-145细胞,另外7株感染PAM细胞)。SD158和SD192株与Resp PRRS MLV株(疫苗株)的核苷酸同源性最高,分别为99.7%和99.4%。对这两株PRRSV与VR-2332、Resp PRRS MLV的各基因的推导氨基酸序列进行分析,结果显示在VR-2332与Resp PRRS MLV株22处差异氨基酸中,SD158株有15处、SD192株有14处氨基酸和Resp PRRS MLV株相同,但二者仅各有6处及7处氨基酸与VR-2332株一致,在鉴别PRRSV VR-2332株与Resp PRRS MLV株的7处可能与毒力相关的氨基酸位点时发现,SD158与SD192株各有5处基酸与VR-2332株相同。根据以上结果推测SD158与SD192株可能来源于PRRSV Resp PRRS MLV株,具有上述分子变化特征的PRRSV在我国的流行状况值得关注。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物,分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PCR条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PCR诊断方法。应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株。试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PCR诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株和美洲株的理化特性及致病性比较

对分离自福建的3株美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与2株欧洲型PRRSV进行了细胞致病性、动物致病性及理化特性的比较试验,结果显示PRRSV分离株均能在Marc-145细胞上增殖并产生细胞病变,但在PK-15、Vero、CEF、MDEF中盲传3代均不能产生细胞病变。理化性质试验表明美洲株与欧洲株PRRSV对酸、pH=3、氯仿、胰酶的敏感性一致;当pH=9时,PRRSV欧洲株比美洲株具有更强的抵抗力;不同的PRRSV毒株对温度的敏感性差异较大,同一型的病毒对温度的敏感性也不同。动物致病性试验结果表明欧洲型PRRSV-FJ0602株为弱毒株,对保育猪不具有致病性,而美洲型PRRSV-FJ0604株致病力强。

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的遗传变异分析

对来自河南省部分地区159份临床PRRS组织样品进行RT-PCR检测,并对阳性样品病毒ORF5扩增、测序和生物信息学分析。为河南省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分子流行病学提供了数据支撑,对于针对性PRRS防控和研制疫苗具有一定的参考意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332bp(经典株)和241bp(变异株),根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。

建立快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株RT-PCR方法的研究

为了快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,试验通过建立的RT-PCR方法获得电泳条带大小不同的PCR产物,以此区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,并用RT-PCR方法检测实验室保存的12份临床阳性样品。结果表明：可以通过RT-PCR方法区分经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株,并且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等猪常见病毒无交叉反应;临床样品检测试验显示,1份为经典毒株、5份为高致病性毒株、5份为天津疫苗株,与测序结果相符。说明试验成功建立了同时区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株的RT-PCR方法,且特异性强、灵敏度较高、重复性好、操作简单。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护机制及疫苗研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的高变异性、免疫逃逸以及异源毒株间的交叉保护效果差,致使现有疫苗保护效力的持久性和有效性受限。本文归纳了PRRSV国内外流行毒株的进化和抗原变异以及毒株中和表位的免疫保护机制研究现状,系统分析了传统疫苗、反向遗传学构建的嵌合疫苗、基因工程疫苗、干扰素诱导激活疫苗以及纳米疫苗等的研究进展,提出了通过不断改良佐剂、改进接种方式等途径开发新型PRRSV疫苗,有望加快终结PRRS的全球流行,为研发安全高效的新型PRRSV疫苗提供了参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征

对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株HB-2(sh)/2002的全基因组序列进行了测定与分析.该毒株基因组全长为15 373 nt(不包括PolyA尾),与国内外美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于88.7%～95.1%之间.序列分析表明,该毒株是1个天然存在缺失的变异毒株,其ORF1a的Nsp2存在编码12个氨基酸的连续36个核苷酸的缺失,ORF3存在编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失.这是国内外首次发现PRRSV存在缺失变异现象,研究结果补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础.

猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)YA株为材料 ,采用RT -PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长 6 0 3bp ,可编码 2 0 0个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR - 2 332株在氨基酸水平上的同源性分别为 5 8%和 90 % ,与国内首株分离株 (CH - 1a)的同源性高达 95 % ,推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列 ,与具有代表性的 12株美洲型毒株和 2株欧洲型毒株绘制进化系统树 ,结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近 ,而与欧洲型毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析 ,发现YA株ORF5编码的E蛋白存在 5个潜在的N -糖基化位点 ,6个抗原位点 ,其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲型毒株均存在一定程度的差异 ,但

猪繁殖-呼吸综合征病毒上海株的分离鉴定

从上海地区 5个发病猪场的病料中 ,分离到 3株致Marc_145细胞病变的病毒 :SH1、SH2 和SH3,理化特性研究表明 ,3株分离毒均对氯仿、乙醚、甲醛、热 (5 6℃ )、酸 (pH6以下 )、碱 (pH8以上 )敏感。负染可见病毒以大小不等的具囊膜的球形粒子为主 ,囊膜上有纤突 ,直径为 6 0～ 10 0nm ;超薄切片可见病毒粒子分散在细胞浆内 ,直径为 45～ 80nm。间接免疫荧光试验表明 ,3株分离毒均与PRRSV高免血清呈强阳性反应 ,而与HCV、PPV、PRV、TGEV高免血清的反应均呈阴性。综上可见 。

猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染对仔猪免疫机能影响的差异

20日龄猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阴性健康仔猪滴鼻感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Hn-1/06强毒株和BJ-4弱毒株,于接种后0、5、11、18、30、405、0 d无菌采血,制备血清和分离白细胞,并在感染猪发病死亡或第50天后分别剖杀取各器官组织。经RT-PCR方法检测,强弱毒株在血清、白细胞和各组织器官内分布基本一致;经ELISA方法和免疫荧光抑制试验及IFA流式细胞术检测,强弱毒株感染均诱导机体产生抗N蛋白抗体,强毒株的抗N蛋白抗体产生早于弱毒株;强毒株感染未能诱导产生中和抗体,弱毒株感染后第30天诱导产生了较低水平的中和抗体,随后逐步升高;在整个感染过程中,强毒感染猪CD3+T淋巴细胞及CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群均下降,CD4+/CD8+比值远远小于对照组,弱毒感染猪CD3+T淋巴细胞及CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群先下降,40 d后逐渐恢复正常水平,CD4+/CD8+比值先下降,11 d后开始逐步上升,18 d后超过对照组,近50 d恢复到正常水平。结果说明,在强毒株感染过程中,细胞免疫被抑制,不能产生有效的体液免疫,导致病毒快速增殖复制;在弱毒株感染过程中,细胞免疫和体液免疫先被抑制,后免疫功能逐步恢复正常水平,使体内病毒进一步被清除。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据 PRRSV HuN4 株基因组序列设计并合成 PRRSV 特异性引物,应用 RT-PCR 技术分6段扩增了 PRRS VHuN4 株全基因组 cDNA。将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于 pBlueScriptⅡSK(+)载体中构建了感染性重组质粒 pHuN4。并在病毒 cDNA5'末端引入 sp6 启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段 Poly(A)尾引入 NotⅠ酶切位点用于线性化 pHuN4;此外,将 HuN4 基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个 MluⅠ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。pHuN4 通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在 Marc-145 细胞中救获病毒。结果显示:救获的病毒能够在 Marc145 细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异。利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100%,在感染后20d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得 PRRSV 强毒 HuN4 株感染性克隆,为从基因水平上研究 PRRSV 的致病机制提供了技术平台。

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的致病性试验

【目的】研究从江西、湖南发生持续高热的病猪体内分离的4株NSP2基因缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2的致病力。【方法】通过Reed—Muench法，测定4株PRRSV（第3代）的TCID50，将毒株分别接种PRRSV和猪圆环病毒2型（PCV2）抗原与抗体均为阴性的健康猪，各设同居试验猪，通过检测体温、临床症状观察、RT—PCR、ELISA、病理切片等方法检测病毒的致病性。【结果】4株病毒的TCID50为10^-3.75～10^-4.5／mL。攻毒试验猪和同居试验猪均表现典型猪繁殖与呼吸综合征临床症状，最后试验猪均死亡。病理切片也显示典型的猪繁殖与呼吸综合征病理变化，并在脑组织内检测到PRRSV核酸。【结论】4株PRRSV分离株的致病力增强。