猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵宿主细胞途径研究进展

病毒入侵宿主细胞是其完成自身复制周期的首要步骤。全面解析病毒入侵宿主细胞途径可深入揭示病毒感染及其致病机制,有助于制定更为有效的抗病毒策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是具有囊膜的单股正链RNA病毒,对全球养猪业造成巨大的经济损失。以往研究报道PRRSV主要通过网格蛋白介导的内吞途径(CME)入侵宿主细胞。近年来研究发现,除CME外,PRRSV还会采取其他途径入侵宿主细胞。本文通过总结PRRSV入侵宿主细胞途径的最新研究进展,以期加深人们对PRRSV的认识,并为防控该病毒提供新的思路。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组毒株GX-C4CG6致病性探究

为评估猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组毒株GX-C4CG6对小猪的致病性,选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的小猪进行攻毒试验,然后通过攻毒后猪只体温变化及死亡情况、临床症状评分、血清抗体变化、攻毒后平均日增重、解剖后肺脏眼观及显微病理变化、血清/肺脏病毒拷贝数等指标,对该毒株致病性进行评估。结果显示:GX-C4CG6毒株攻毒组有4头猪出现发烧,平均体温在攻毒后第12、13天大于40℃,最高体温达40.4℃,未出现死亡;被攻毒猪仅表现轻微减料,未表现出明显的呼吸障碍;攻毒后7 d,攻毒组猪只抗体开始转阳,至攻毒后14 d,攻毒组猪只ELISA抗体S/P平均值达最高;攻毒组在攻毒后第1周和对照组平均日增重差异不显著,至第2周差异显著(P<0.05),攻毒组显著低于对照组;被攻毒猪出现肺脏间质性肺炎,血清和肺脏病毒拷贝数浓度较高,分别达9.2×10^(5)和1.6×10^(7)copies/mL。结果表明,PRRSV GX-C4CG6毒株对小猪表现温和致病性。本研究为PRRSV重组毒株流行的控制提供了基础资料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的持续感染和传播特点及防控出路

1PRRS简述。1987年,美国首次暴发猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),随后在世界各国陆续暴发该病,截至目前PRRS已遍布世界主要的养猪业国家,成为各国养猪业最为严重的疫病之一,每年给全球养猪业造成数十亿甚至上百亿美元的经济损失。

^(60)Coγ射线对新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活研究

用60 Coγ射线对不同状态不同体积的鸡新城疫病毒(NDV)、H9N2亚型禽流感(H9N2AIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行辐照,研究60 Coγ射线对灭活疫苗中病毒的灭活效果。结果表明,6.0kGy 60 Coγ射线辐照对冷冻和液态下5000和10000mL的NDV、H9N2亚型AIV和PRRSV均不能灭活,辐照后NDV和H9N2亚型AIV冷冻尿囊液的HA效价降低而液态尿囊液的HA效价升高;液态下,60 Coγ射线能够灭活250mL细胞培养液中的PRRSV,不能灭活250、5000和10000mL尿囊液中的NDV和H9N2AIV,250mL与5000、10000mL的NDV HA效价间差异显著(P<0.05)。60 Coγ射线辐照对液态的PRRSV细胞培养液灭活效果良好,有望用于灭活苗的病毒灭活。

猪繁殖与呼吸综合征病毒促进猪链球菌2型感染猪肺泡巨噬细胞的初步研究

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对不同毒力猪链球菌2型(SS2)感染巨噬细胞的影响,本研究建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)的模型,实验分为4组:HA单独感染组(HA组)、PRRSV-HA共感染组(PRRSV-HA组)、T1/5单独感染组(T1/5组)和PRRSV-T1/5共感染组(PRRSV-T1/5组),利用该模型通过黏附试验、侵入试验和细胞内存活试验检测PRRSV对HA和T1/5黏附、侵入iPAM细胞及对该细胞存活率的影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测各感染组iPAM模型细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平。黏附试验结果显示,HA感染2 h后,PRRSV-HA组细菌对细胞的黏附水平极显著高于HA组(P<0.01或P<0.001);T1/5感染6 h后,PRRSV-T1/5组细菌对细胞的黏附水平极显著高于T1/5组(P<0.001),表明PRRSV与HA或T1/5共感染可以促进HA和T1/5对iPAM模型细胞的黏附,且HA对iPAM细胞的黏附水平高于T1/5。侵入试验结果显示,感染4 h后,共感染组细菌侵入iPAM细胞中的数量比单独感染组极显著增多(P<0.01或P<0.001)。细胞内存活试验结果显示,感染2 h后,共感染组细菌的存活率比单独感染组极显著升高(P<0.001)。荧光定量PCR试验结果显示,感染4 h时,共感染组iPAM细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平极显著高于单独感染组(P<0.001)。本研究首次建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染i PAM的模型,基于该模型研究首次发现PRRSV感染不仅促进了不同毒力SS2对i PAM细胞的黏附、侵入及SS2在iPAM细胞内的存活,还可以协同SS2显著提高该细胞中细胞因子的转录水平。本研究为进一步探究PRRSV和SS混合感染的机制提供了参考依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白多克隆抗体,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法,通过PCR扩增N蛋白基因,将N蛋白基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导N蛋白表达,将纯化后的重组N蛋白免疫小鼠,获得N蛋白多克隆抗体。将纯化后的N蛋白作为抗原,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法,并评估该方法的特异性、重复性和准确性。结果表明,表达的重组N蛋白呈可溶性,制备的N蛋白多克隆抗体ELISA效价能达到1∶2048000,IFA和Western blot结果表明制备的鼠多克隆抗体能特异性识别PRRSV N蛋白。建立的间接ELISA方法特异性良好,重复性试验变异系数均小于10%,且与同类型商品化试剂盒结果比较,符合率达到91.10%,可为PRRSV N蛋白的免疫学检测和结构功能的研究提供参考。

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白是病毒主要囊膜结构蛋白和中和抗体主要靶蛋白,广泛应用于PRRS新型疫苗和诊断技术的研究。为获得具有与天然构象相近的PRRSV GP5蛋白,本研究根据草地贪夜蛾(Spdopterafrugiperda)密码子偏好性,优化PRRSV ORF5基因编码密码子,并克隆至杆状病毒载体后转染Sf9昆虫细胞,构建了重组杆状病毒rBac-PRRSV-GP5。经Western blot证实GP5蛋白在Sf9细胞中获得高效表达,且具有良好的免疫反应原性。经镍离子亲和层析纯化后,获得高纯度的重组GP5蛋白,为开展PRRSV诊断技术研发、生物学功能研究等奠定了抗原基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒2型TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为了准确、特异、高效地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(PRRSV2),本研究根据GenBank上登录的PRRSV2不同谱系流行毒株的ORF6基因序列,选取保守区域设计合成了1对特异性检测引物和1条MGB探针,经优化退火温度、引物和探针比例等反应条件及敏感性、特异性、重复性试验,建立了检测PRRSV2的TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果:以猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(PRRSV1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪细小病毒(PPV)等阳性核酸为模板,均无扩增;对标准质粒的最低检测下限为1×10^(1)copies/μL,建立的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.994;稳定性和重复性好,批内和批间变异系数均小于1.78%。应用该方法对保留的30份临床阳性样品进行检测,结果阳性100%,Ct值在22~36间。综上,本研究建立的TaqMan MGB荧光定量PCR方法可用于临床和实验室中PRRSV2的快速检测,为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供了技术支持。

2013—2021年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查

【目的】调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。【方法】采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。【结果】检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现:高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。【结论】猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

“芪优能”对感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)仔猪免疫功能及病理损伤的影响

[目的]研究黄芪全成分提取物“芪优能”对感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)断奶仔猪免疫功能和病理损伤的影响。[方法]选取呈PRRSV阳性的28日龄断奶仔猪32头,随机分为组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ,每组8只。试验周期42 d,在试验第1周和第5周,组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ基础日粮中分别添加0、200、500、1000 g/t的“芪优能”。试验结束后第1天,前腔静脉采血,采用实时荧光定量RT-PCR测定各组仔猪血清中PRRSV的病毒载量,应用ELISA法检测血清中免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)和细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)含量;每组剖杀3头仔猪,采集肺脏、肺门淋巴结和脾脏组织样本,制备石蜡切片,利用HE染色法、Masson三色染色法和免疫荧光双重标记染色法观察病理组织学变化。[结果]与组Ⅰ相比,组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ仔猪血清中的PRRSV拷贝数均极显著(P<0.01)降低,组Ⅲ和组Ⅳ仔猪血清中IL-2、IFN-γ含量极显著(P<0.01)升高,组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ仔猪血清中IgG含量均极显著(P<0.01)升高,组Ⅲ和组Ⅳ仔猪血清中IgA含量分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)升高。病理组织学分析显示,与组Ⅰ相比,组Ⅲ、组Ⅳ仔猪的肺脏、肺门淋巴结和脾脏损伤程度明显减弱;组Ⅱ仔猪肺脏组织的CD68阳性巨噬细胞占比显著(P<0.05)升高,组Ⅲ、组Ⅳ仔猪肺脏组织的CD68阳性巨噬细胞占比均极显著(P<0.01)升高,组Ⅲ和组Ⅳ仔猪肺脏组织的CD163阳性巨噬细胞占比极显著(P<0.01)升高,组Ⅲ、组Ⅳ仔猪肺脏组织的CD163/CD68比值极显著(P<0.01)升高。[结论]在PRRSV感染仔猪基础日粮中添加黄芪全成分提取物“芪优能”,具有降低病毒载量、增强免疫功能及减轻肺脏、脾脏、肺门淋巴结病理损伤的作用,以添加水平为1000 g/t的效果最明显。

基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。

青蒿抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的机制分析

【目的】应用网络药理学方法探明青蒿抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用机制。【方法】用TCMSP数据库检索青蒿的可能活性成分和药物作用靶点,通过CTD数据库和GeneCards数据库收集猪繁殖与呼吸综合征病毒疾病靶点,筛选出药物和疾病靶点的交集来构建蛋白质互作网络并进行GO功能与KEGG通路富集分析,对筛选出的主要活性成分与核心靶点进行分子对接验证。【结果】青蒿有19种可能活性成分和268个药物靶点,主要可能活性成分有槲皮素、山奈酚和木犀草素。PRRSV疾病靶点有3366个,其与青蒿的交集靶点有126个。青蒿抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的核心靶点有白介素-6、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1β、前列腺素内过氧化物合成酶2、基质金属蛋白酶9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和AP-1转录因子亚单位等。GO功能富集涉及对外源性物质刺激的反应、基因表达正调控、细胞外间隙、细胞表面、酶结合及蛋白结合等,KEGG通路主要涉及TNF、白介素-17(IL-17)等信号通路。分子对接结果显示青蒿主要活性成分与核心靶点均能实现自发结合。【结论】青蒿抗猪繁殖与呼吸综合征病毒主要有效成分可能为槲皮素、山奈酚、木犀草素,可能通过作用于IL-17和TNF信号通路发挥抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用。

连翘抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的机制分析

【目的】用网络药理学方法探明连翘抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的潜在有效成分和作用机制。【方法】在TCMSP数据库收集连翘的潜在活性成分与作用靶点,在CTD数据库和GeneCards数据库收集PRRSV疾病靶点,获取两者的交集靶点后构建蛋白-蛋白互作网络,并进行基因本体(GO)功能富集分析和KEGG通路分析,之后对筛选出的主要活性成分和核心靶点进行分子对接验证。【结果】连翘有24种潜在活性成分和243个潜在作用靶点,PRRSV疾病有3368个作用靶点,两者有122个交集靶点。GO功能富集得到890个条目,主要涉及基因表达的正向调控、对外源性刺激的反应、细胞外空间、胞外区等、酶的结合及相同蛋白的结合等。KEGG通路分析共获得176个条目,主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、白介素-17(IL-17)和肿瘤坏死因子(TNF)等信号通路。进一步分析显示,连翘抗PRRSV的主要潜在活性成分有槲皮素、山奈酚、木犀草素及连翘酯苷A等,核心靶点有TNF、白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤蛋白p53、基质金属蛋白酶9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、前列腺素内过氧化物合成酶2和表皮生长因子受体。分子对接结果显示连翘的潜在主要活性成分与核心靶点之间均能实现良好结合。【结论】连翘抗PRRSV主要活性成分可能为槲皮素、山奈酚、木犀草素及连翘酯苷A,可能主要通过PI3K-Akt、MAPK、IL-17和TNF等信号通路发挥作用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种烈性传染病。PRRSV的非结构蛋白2(NSP2)编码一个多功能蛋白,具有广泛生物学作用。本文对NSP2遗传变异分析,与自身病毒蛋白互作,与宿主蛋白互作,影响PRRSV复制、毒力、细胞噬性,调节宿主免疫以及在疫苗应用等相关研究进行综述,为深入研究PRRSV致病机理和疫苗设计提供重要理论基础。

不同疫苗接种对商品猪群感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

为评价不同免疫方案对商品猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的防控效果,在一规模化猪场选取240头未经PRRS疫苗免疫且无PRRSV感染的断奶仔猪分成3组,组内包含15头耳牌跟踪猪。其中混合免疫组、弱毒疫苗组在25 d免疫PRRS经典毒株弱毒疫苗,混合免疫组在50 d免疫PRRS经典毒株灭活疫苗;对照组不接种PRRS疫苗。试验前称重并记录各组耗料情况,于44 d(首免后20 d)或猪群出现PRRSV感染后每隔10 d采血监测PRRSV病毒血症以及抗体产生情况,试验后称取各组试验猪重量。结果显示,2个组猪在首免后抗体出现上升,于99 d(二免后49 d)猪群产生了较高的抗体水平,并持续到试验结束。而混合免疫组在二免后20 d,对照组在69 d监测到有猪开始出现PRRSV病毒血症,弱毒疫苗组于89 d发现有猪出现病毒血症。表明对试验猪免疫1次PRRS弱毒疫苗,可显著降低猪只感染PRRSV后的病毒血症几率,以及病毒血症持续时间;与未接种疫苗的猪相比,接种PRRS疫苗的猪在料肉比方面没有表现出明显的差异;接种该弱毒疫苗免疫25 d的基础上,加免1针灭活疫苗没有显示出明显优势。

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GD2022株的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东省欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-1)流行情况,将RT-PCR检测PRRSV-1阳性的病料(肺脏和淋巴结)接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病原分离鉴定,以分离毒株核酸作为模板,对分离的PRRSV-1进行全基因克隆和测序,并与国内外PRRSV-1和PRRSV-2参考毒株序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,成功分离1株PRRSV-1,命名为GD2022株,其接种PAMs可引起典型的细胞病变,从出现病变的F5细胞中提取核酸,用PCR分段扩增出PRRSV-1 GD2022株10个基因组片段,分别连接到pCE2 TA/Blunt-Zero载体进行测序,拼接后获得PRRSV-1 GD2022株全基因组长15058个核苷酸(不包含polyA尾)。同源性分析显示,该分离株全基因组序列与PRRSV-1参考毒株(LV株)和PRRSV-2参考毒株(VR2333株)核苷酸序列同源性分别为87%和59.7%。遗传进化树分析显示,全基因序列和ORF5基因与国内外PRRSV-1毒株为同一进化分支,且与疫苗毒分支较远,推断分离株为1株PRRSV-1,属于基因亚型1。氨基酸序列比对分析显示,ORF3和ORF4重叠区域缺失3个核苷酸,导致GP3蛋白和GP4蛋白分别在第245和第65氨基酸位点缺失了1个氨基酸,且与LV株比对,GD2022毒株GP5的氨基酸序列在中和抗原表位第33氨基酸位点(D→A)出现点突变,在高变区第56氨基酸位点(D→A)和第63氨基酸位点(G→D)出现两处突变。重组分析显示,GD2022毒株未发生重组事件。成功分离鉴定1株PRRSV-1毒株,为国内PRRSV-1生物学特性研究提供了材料,也为了解广东省内PRRSV-1流行情况及变异特点提供参考依据。

2016年我国部分地区类NADC30新亚群猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析

为了解类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在我国新的流行特点，本研究根据GenBank中美国2012年提交的PRRSV NADC30株全基因组序列设计合成8对引物，通过RT-PCR的方法对本实验室2016年从4个省搜集的临床样品中检测到的15株类NADC30 PRRSVs株进行了全基因组测序，并且结合参考株进行了序列分析。NSP2推导氨基酸的序列比对表明，15株PRRSVs均具有aa323～aa433＋aa484＋aa505～aa523 （111＋1＋19） 131个氨基酸缺失的分子特征；经RDP4和Simplot生物学软件分析表明，15株PRRSVs中14株为重组病毒株，参与重组的亲本病毒株为PRRSV NADC30株，提供重组基因片段的病毒株为HP-PRRSV或以VR2332为代表的经典PRRSV株，这些类NADC30重组病毒株的重组位置、重组的基因片段及重组片段长度均具有多样性，而且重组的位置多位于编码非结构蛋白或次要结构蛋白的基因区域；全基因组遗传演化分析表明，这些病毒株远离国内之前流行的HP-PRRSV，同源性仅为83.4 %～87.2 %，而与其它的类NADC30病毒株位于一个相对独立的分支，以上结果均表明这类病毒株已形成了一个新的亚群，命名为5亚群。本研究中不同地区PRRSV的核苷酸同源性差异较大，仅为88.6 %～99.6 %，并且只有2个病毒株可以感染PAM和MARC-145细胞。本研究表明，以基因缺失和基因重组多样性为主要特征的5亚群PRRSV已在我国流行，其生物学特性有待进一步研究。

猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型FJ0602株的分离及其ORF7的序列分析

应用Marc-145细胞从福建某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病死猪脾脏和淋巴结中分离到一株病毒。该分离毒经Marc-145细胞6次传代后出现稳定的细胞病变(CPE),为105.25 TCID50/mL;间接免疫荧光试验表明,感染分离毒的CPE细胞仅与抗PRRSV单克隆抗体反应并出现特异性的胞浆荧光;致病性试验表明试验猪接种分离毒后14 d内都表现为体温正常、生长良好,没有出现PRRS的发病症状;序列测定表明分离毒的ORF7基因与LV、AMERVAC、B13、Ningbo42株的核苷酸同源性分别为96.64%、98.45%、95.09%、98.45%,氨基酸同源性分别为98.44%、99.22%、95.31%、99.22%,与VR2332、CH-1a株的ORF7基因差异较大,核苷酸同源性为58.84%、60.45%,氨基酸同源性为55.30%、56.82%,该分离毒与LV、AMERVAC、B13、Ningbo42株在基因型上同属于欧洲型毒株,命名为PRRSV-FJ0602。本研究首次证实欧洲型PRRSV在福建省存在。