猪细环病毒1型间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床应用检测。【结果】确定了检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法的各项最佳反应条件;对8种猪源病毒阳性血清的检测结果显示只有猪细环病毒1型阳性血清为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数均小于5%,批间变异系数均小于10%,显示出良好的重复性。对来源于北京和湖南地区的400份猪血清样品的检测结果显示,猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体阳性率为75.25%,PCR阳性率为71.00%,二者之间没有显著差异(P>0.05),表明这两个地区存在较多的的猪细环病毒1型感染。【结论】建立了一种特异性和重复性都良好的检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA,可用于猪细环病毒1型抗体的临床检测。

中国部分地区猪细环病毒1型和2型的分子检测

细环病毒(TTV)是近年来发现的一种新型人畜共患DNA病毒,广泛存在于包括人类和家畜在内的多种哺乳动物中。目前我国猪群中TTV的流行病学报道较少。为研究猪细环病毒(PTTV)在我国的流行情况,采用聚合酶链反应(PCR)对2009年我国9个省市部分发病猪场中的PTTV1和PTTV2进行检测。结果显示,191份病料中PTTV的总阳性率为77.0%(147/191),其中PTTV1的单一阳性率为68.6%(131/191),PTTV2的单一阳性率为53.9%(103/191),两基因型的共感染率为45.5%(87/191)。进一步分析发现,在不同猪场、不同年龄猪群、不同病料组织中,PTTV的感染情况均不相同。此外,对41份健康猪的血清进行检测,结果显示,PTTV总阳性率、PTTV1单一阳性率、PTTV2单一阳性率及两基因型的共感染率分别为43.9%(18/41)、36.6%(15/41)、24.4%(10/41)和12.2%(5/41)。结果提示,发病猪体内PTTV总阳性率、PTTV1单一阳性率、PTTV2单一阳性率及两基因型的共感染率均显著高于健康猪(P<0.01)。PTTV在临床上是否对猪致病或与其他病原有协同作用,需进一步研究。

猪细环病毒和猪圆环病毒2型混合感染状况的调查

为分析我国猪细环病毒(TTSuV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的共感染情况,利用所设计的TTSuV(TTSuV1、TTSuV2)和PCV2特异性引物对我国29个省市采集的猪群血清样品同时进行PCV2和TTSuV(TTSuV1、TTSuV2)PCR检测,分析混合感染情况。结果所检测的1 898份样品中,TTSuV阳性为1 103份(58%),PCV2阳性为435份(23%)。阳性样品中呈混合感染的有275份(14%),其中TTSuV1和PCV2为249份(13%),TTSuV2和PCV2为200份(10%),均为阳性的有174份(9%)。调查结果显示,我国猪群中TTSuV和PCV2混合感染现象较为普遍,对地区性分布特征和饲养模式等影响因素的分析表明TTSuV和PCV2混合感染情况存在地区性差异(P<0.01),但饲养模式并不是共感染的关键因素。

猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪细环病毒1型和2型,根据猪细环病毒的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。选择猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性;用质粒标准品进行TTSuV1和TTSuV2的PCR-DHPLC检测,灵敏度可达1.0×101拷贝·μL-1。对80份血清样本分别应用实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法及本文所建立的PCR-DHPLC法与进行检测,发现TTSuV1有63份PCR-DHPLC阳性,63份实时荧光PCR阳性,54份PCR-凝胶电泳阳性;TTSuV2有69份PCR-DHPLC阳性,69份实时荧光PCR阳性,56份PCR-凝胶电泳阳性。本试验建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。

猪细环病毒两种基因型双重PCR检测方法的建立

为建立检测猪细环病毒两种基因型(PTTV1和PTTV2)的双重PCR方法,本研究根据GenBank中PTTV1、PTTV2的UTR基因序列,设计合成了2对特异引物,并通过对扩增条件的筛选,建立了PTTV1和PTTV2的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PTTV1的324 bp和PTTV2的522 bp特异性片段,而扩增猪圆环病毒2型和猪细小病毒DNA结果均为阴性,对PTTV1和PTTV2的最低检出量分别为100 copies和10 copies。该方法适合对PTTV1和PTTV2的联合检测。

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法。结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应。临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92%和87.3%,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群。该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法。

猪细环病毒数字PCR定量检测方法的建立

[目的]实现猪细环病毒(TTSuV)的准确定量检测。[方法 ]根据TTSuV的序列特点,设计特异性引物、探针,建立数字PCR检测技术。对数字PCR反应体系中的引物和探针浓度进行优化,分析方法的灵敏度、特异性,并初步应用于进行临床检测。[结果 ]最终确定TTSuV1a和TTSuV1b数字PCR反应体系中最佳引物浓度均为250 nmol/L,最佳探针浓度均为300 nmol/L,TTSuV1a型和TTSuV1b型灵敏度均可达到单个拷贝数;以猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,结果无交叉反应;批内和批间试验表明,该方法的重复性良好;本实验室留存的92份血清样本的检测结果与其背景信息一致。[结论 ]本研究建立的TTSuV数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于TTSuV的定量检测。

猪细环病毒1b型ORF3基因克隆及序列分析

为明确福建省猪细环病毒(porcine torque teno sus virus,PTTSuV)1b型(PTTSuV-1b)ORF3基因的遗传进化特征,本研究根据GenBank中登录的PTTSuV-1b基因组特征设计特异性引物,对福建省某猪场患有仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的猪血清进行PTTSuV-1b分段扩增,并分别对PCR扩增产物进行胶回收后克隆测序,将测序结果经BLAST分析后进行序列拼接。试验结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的PTTSuV-1bORF3蛋白,全长为600bp,编码有199个氨基酸。将获得的PTTSuV-1b型福建株与GenBank中PTTSuV-1b型的ORF3基因进行比对分析,其与FJ/China/2010/TTV2/2株核苷酸同源性最高,为99.7%,与西班牙PTTSuV-1b分离株TTV2_G43核苷酸同源性为97.3%,与SC株核苷酸同源性稍低,但也达94.0%;而与猪细环病毒K2型德国家猪分离株472142株核苷酸同源性仅为60.7%,与猪细环病毒1a型西班牙分离株PTTV1_1914株核苷酸同源性仅为46.8%。从遗传进化关系上看,PTTSuV-1bORF3基因在遗传进化上呈2个大的遗传进化分支(分支Ⅰ和分支Ⅱ),本研究分离株处于分支Ⅰ。

猪细环病毒k2型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立检测猪细环病毒k2型（Porcine Torque teno sus virus k2,PTTSu Vk2）SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,本研究根据PTTSu Vk2 ORF2基因序列特征设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PTTSu Vk2的实时荧光定量PCR方法,该方法在PTTSu Vk2 ORF2基因含量为1.92×102~1.92×107 copies/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物溶解曲线分析仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为（83.83±0.08）℃,对猪圆环病毒（Porcine circovirus type 1 and type 2,PCV1和PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪博卡病毒5型（Porcine bovavirus type 5,Pbo V5）、猪细环病毒1a型（PTTSu V 1a）和1b型（PTTSu V 1b）核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.39%~1.69%,组间变异系数0.69%~2.19%。本方法的建立可用于定量分析PTTSu Vk2感染噬性组织器官和感染程度,为PTTSu Vk2的流行病学研究及临床诊断等提供了一种可靠的方法。

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。

江苏地区猪细环病毒分子流行病学调查

猪细环病毒(Torque tenosusvirus,TTSuVs)是近年来新发现的一种DNA病毒,广泛分布于家猪和野猪体内。为研究TTSuVs在江苏地区猪群中的分布情况,及其各分离株之间的进化关系,本实验采用PCR技术对来自江苏地区6个猪场的398份血清样品进行TTSuVs检测,挑选部分阳性样品扩增其5'-UTR基因片段,并将所获得的基因序列与国外已报道的5'-UTR基因序列进行进化树分析比较。结果显示,TTSuVs可分为TTSuV1和TTSuV2两大分支,其单一阳性检出率分别为58.4%(227/398)和48.0%(198/398),混合阳性检出率为15.4%(64/398)。TTSuV1和TTSuV2均可分为3个亚群,本实验所获得的TTSuVs分离株在各自亚群中均有分布,地域差异不明显。江苏地区TTSuVs分离株与国外某些国家的TTSuVs分离株之间有较高的亲缘关系。本实验表明,TTSuVs感染在江苏地区猪群中普遍存在,并对我国养猪产业构成潜在威胁。

猪细环病毒流行病学及致病性研究进展

猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSuV)1999年由美国学者报道,随后多个国家都相继证实了该病毒在猪群中广泛存在。文章就猪细环病毒流行范围、病毒遗传变异、易感动物、传播途径和其致病性最新研究进行综述。

猪细环病毒1a型ORF1基因的克隆与序列分析

为明确猪细环病毒(porcine Torque teno sus virus,PTTSuV)1a型福建株ORF1基因的特征,本研究采用分段扩增的办法从PTTSuV 1a型感染阳性粪便中扩增PTTSuV 1a型福建株ORF1基因,对PCR扩增产物胶回收克隆测序后利用SeqMan软件拼接出完整的PTTSuV 1a型福建株ORF1基因,通过分子生物学软件对其编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,PTTSuV 1a型福建株ORF1基因全长为1 947bp,编码648个氨基酸,其理论等电点为10.06。核苷酸同源性比对结果表明,本试验PTTSuV 1a型福建株ORF1基因和PTTSuV 1a型TTV1Bj2-1株(GenBank登录号:HM633243)同源性最高,达99.7%。利用Mega 6.06绘制其遗传进化树,可见PTTSuV1a型ORF1基因在遗传进化上呈两个大的遗传进化分支(分支Ⅰ和分支Ⅱ),分支Ⅰ又可分为两个小的分支(Ⅰa和Ⅰb),本研究为丰富福建源PTTSuV 1a型分子流行病学数据库奠定基础。

我国部分地区猪圆环病毒2型和猪细环病毒混合感染的调查

为了解猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪细环病毒(TTV)混合感染情况,用PCR方法对来自湖南、江西、广东、福建和广西五省区的193份猪组织样品进行PCV-2、TTV-1和TTV-2进行检测。结果显示,PCV-2感染率为61.1%(118/193),PCV-2和TTV-1混合感染率为32.1%(62/193),PCV-2和TTV-2混合感染率为16.9%(32/193),3种病原混合感染率为9.8%(19/193),2006年PCV-2和TTV的混合感染率最高。由此可见,目前猪群中存在PCV-2和猪TTV的混合感染,PCV-2和TTV-1型混合感染率高于和TTV-2型的混合感染率,且存在一定比例的三重感染情况。

猪细环病毒2型荧光定量PCR检测方法的优化

【目的】优化1种猪细环病毒2型(TTSu V2)的荧光定量PCR检测方法。【方法】对原有引物进行调整设计,以原有重组质粒为模板来重新进行检测TTSu V2 DNA的SYBR Green I real-time PCR扩增。【结果】新的TTSu V2 SYBR Green I荧光定量PCR的扩增效率为99.3%,标准曲线的决定系数为0.998,可准确检测的最低核酸模板浓度为50 copies/μL。与原方法相比较,新方法在熔解曲线、特异性、重复性方面都非常接近,但在扩增曲线方面得到明显改善,其可准确定量检测的灵敏度提高了至少10倍以上,临床检测数据也更加准确可靠。【结论】建立了一种新的准确灵敏度更高的定量检测TTSu V2的荧光定量PCR方法。

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

猪细环病毒和猪圆环病毒2型混合感染的检测

为诊断中牟某猪场送检病料的感染类型,调查了其流行病学、临床症状和病理剖检特征,并采用PCR检测技术对其进行检测。结果表明,该猪场存在猪细环病毒与猪圆环病毒2型的混合感染。

部分地区猪细环病毒1型感染的流行情况调查

猪细环病毒1型是近年来发现的又一种环状DNA病毒,可能存在潜在致病作用。为了初步了解其流行情况,用PCR技术和ELISA技术对来自京津冀、华东与华南地区578头保育猪血清样品进行了检测。结果显示,猪细环病毒1型的核酸与抗体的猪场阳性率均为100%;核酸阳性率为73.88%,抗体阳性率为78.72%,二者之间无显著差异(P>0.05)。进一步分析发现,猪细环病毒1型的核酸阳性率和抗体阳性率都超过50%的猪场达到86.67%,都超过80%的占53.33%。调查结果表明,猪细环病毒1型感染在我国部分地区普遍流行,其在多数猪场的感染率很高。

猪细环病毒2型感染与断奶后多系统衰竭综合征的相关性分析

【目的】分析猪细环病毒2型(TTSuV2)感染与猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的发生是否存在临床相关性。【方法】采集35头临床疑似PMWS病猪和35头同群健康猪的血清,用综合诊断方法来确认PMWS病猪与猪圆环病毒2型(PCV2)亚临床感染猪,用荧光定量PCR方法检测PCV2与TTSuV2载量,对2种病毒载量分别进行差异分析,并对二者进行相关性分析。【结果】经综合诊断确认,有24头PMWS病猪和27头PCV2亚临床感染猪,前者血清中PCV2载量与TTSuV2载量都极显著(P<0.01)高于后者,且TTSuV2载量与PCV2载量之间存在极显著(P<0.01)相关。【结论】PMWS与TTSuV2感染在临床上存在一定相关。

猪细环病毒检测方法研究进展

猪细环病毒(TTSuV)是近年来新发现的DNA病毒,在世界猪群中广泛存在,严重威胁着养猪业的发展,而且有潜在跨物种传播给人类的可能性,引起了养猪业的极大关注。通过综述TTSuV近年来检测方法研究进展,以期对科研工作者和广大养殖业主更好地防治该病提供参考。