猪细环病毒1型间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床应用检测。【结果】确定了检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法的各项最佳反应条件;对8种猪源病毒阳性血清的检测结果显示只有猪细环病毒1型阳性血清为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数均小于5%,批间变异系数均小于10%,显示出良好的重复性。对来源于北京和湖南地区的400份猪血清样品的检测结果显示,猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体阳性率为75.25%,PCR阳性率为71.00%,二者之间没有显著差异(P>0.05),表明这两个地区存在较多的的猪细环病毒1型感染。【结论】建立了一种特异性和重复性都良好的检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA,可用于猪细环病毒1型抗体的临床检测。

中国部分地区猪细环病毒1型和2型的分子检测

细环病毒(TTV)是近年来发现的一种新型人畜共患DNA病毒,广泛存在于包括人类和家畜在内的多种哺乳动物中。目前我国猪群中TTV的流行病学报道较少。为研究猪细环病毒(PTTV)在我国的流行情况,采用聚合酶链反应(PCR)对2009年我国9个省市部分发病猪场中的PTTV1和PTTV2进行检测。结果显示,191份病料中PTTV的总阳性率为77.0%(147/191),其中PTTV1的单一阳性率为68.6%(131/191),PTTV2的单一阳性率为53.9%(103/191),两基因型的共感染率为45.5%(87/191)。进一步分析发现,在不同猪场、不同年龄猪群、不同病料组织中,PTTV的感染情况均不相同。此外,对41份健康猪的血清进行检测,结果显示,PTTV总阳性率、PTTV1单一阳性率、PTTV2单一阳性率及两基因型的共感染率分别为43.9%(18/41)、36.6%(15/41)、24.4%(10/41)和12.2%(5/41)。结果提示,发病猪体内PTTV总阳性率、PTTV1单一阳性率、PTTV2单一阳性率及两基因型的共感染率均显著高于健康猪(P<0.01)。PTTV在临床上是否对猪致病或与其他病原有协同作用,需进一步研究。

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

部分地区猪细环病毒1型感染的流行情况调查

猪细环病毒1型是近年来发现的又一种环状DNA病毒,可能存在潜在致病作用。为了初步了解其流行情况,用PCR技术和ELISA技术对来自京津冀、华东与华南地区578头保育猪血清样品进行了检测。结果显示,猪细环病毒1型的核酸与抗体的猪场阳性率均为100%;核酸阳性率为73.88%,抗体阳性率为78.72%,二者之间无显著差异(P>0.05)。进一步分析发现,猪细环病毒1型的核酸阳性率和抗体阳性率都超过50%的猪场达到86.67%,都超过80%的占53.33%。调查结果表明,猪细环病毒1型感染在我国部分地区普遍流行,其在多数猪场的感染率很高。

四川地区猪细环病毒1型的流行病学调查和分子特征研究

为了解猪细环病毒1型(TTSuV1)在四川地区猪群中的流行情况及其遗传进化关系,采用PCR对四川省不同地区的5个规模化猪场采集的140份临床健康猪血清进行检测,并根据NCBI已发表的TTSuV1的全基因组序列,对TTSuV1中的2个亚型TTSuV1a和TTSuV1b进行全基因的扩增。结果显示,在140份临床健康猪血清样本中TTSuV1a和TTSuV1b的阳性检出率分别为49.29%(95%CI:40.7%~57.9%)和39.29%(95%CI:31.1%~47.9%)。通过克隆转化,序列测定后拼接获得TTSuV1a的近似全基因组长为2 497bp,TTSuV1b为2 693bp,对测得序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,扩增得到TTSuV1a的ORF1和ORF2序列,与国内外已发表的参考毒株间的核苷酸同源性分别为79.3%~97.5%和92.7%~98.2%,TTSuV1b的ORF1、ORF2序列与其他参考毒株间的核苷酸同源性分别为100%和97.1%~98.6%,分析表明其差异较小,亲缘关系较近。研究结果为四川省部分地区猪群中TTSuV1的流行情况提供数据参考,为进一步研究TTSuV的遗传进化提供一定的理论依据。

猪细环病毒1型感染与猪繁殖与呼吸综合征的相关性分析

【目的】分析猪细环病毒1型(TTSuV1)感染与猪繁殖与呼吸综合征(PPRS)的发生是否存在相关性。【方法】采集40头临床疑似PRRS病猪血清和40头同群健康猪血清,确认PRRS病猪与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)亚临床感染猪,用荧光定量PCR方法检测TTSuV1和PRRSV载量,进行差异比较和相关性分析。【结果】常规PCR结合荧光定量PCR检测确认有31头PRRS病猪和27头PPRSV亚临床感染猪,前者PRRSV载量极显著(P<0.01)高于后者;虽然PRRS病猪的TTSuV1载量高于PRRSV亚临床感染猪,但其差异不显著。PRRSV感染猪的血清中的TTSuV1载量与PRRSV载量之间无显著(P>0.05)相关性。【结论】TTSuV1感染与PRRS发生之间可能没有相关性。

猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。

猪细环病毒1b型ORF3基因克隆及序列分析

为明确福建省猪细环病毒(porcine torque teno sus virus,PTTSuV)1b型(PTTSuV-1b)ORF3基因的遗传进化特征,本研究根据GenBank中登录的PTTSuV-1b基因组特征设计特异性引物,对福建省某猪场患有仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的猪血清进行PTTSuV-1b分段扩增,并分别对PCR扩增产物进行胶回收后克隆测序,将测序结果经BLAST分析后进行序列拼接。试验结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的PTTSuV-1bORF3蛋白,全长为600bp,编码有199个氨基酸。将获得的PTTSuV-1b型福建株与GenBank中PTTSuV-1b型的ORF3基因进行比对分析,其与FJ/China/2010/TTV2/2株核苷酸同源性最高,为99.7%,与西班牙PTTSuV-1b分离株TTV2_G43核苷酸同源性为97.3%,与SC株核苷酸同源性稍低,但也达94.0%;而与猪细环病毒K2型德国家猪分离株472142株核苷酸同源性仅为60.7%,与猪细环病毒1a型西班牙分离株PTTV1_1914株核苷酸同源性仅为46.8%。从遗传进化关系上看,PTTSuV-1bORF3基因在遗传进化上呈2个大的遗传进化分支(分支Ⅰ和分支Ⅱ),本研究分离株处于分支Ⅰ。

猪细环病毒1a型ORF1基因的克隆与序列分析

为明确猪细环病毒(porcine Torque teno sus virus,PTTSuV)1a型福建株ORF1基因的特征,本研究采用分段扩增的办法从PTTSuV 1a型感染阳性粪便中扩增PTTSuV 1a型福建株ORF1基因,对PCR扩增产物胶回收克隆测序后利用SeqMan软件拼接出完整的PTTSuV 1a型福建株ORF1基因,通过分子生物学软件对其编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,PTTSuV 1a型福建株ORF1基因全长为1 947bp,编码648个氨基酸,其理论等电点为10.06。核苷酸同源性比对结果表明,本试验PTTSuV 1a型福建株ORF1基因和PTTSuV 1a型TTV1Bj2-1株(GenBank登录号:HM633243)同源性最高,达99.7%。利用Mega 6.06绘制其遗传进化树,可见PTTSuV1a型ORF1基因在遗传进化上呈两个大的遗传进化分支(分支Ⅰ和分支Ⅱ),分支Ⅰ又可分为两个小的分支(Ⅰa和Ⅰb),本研究为丰富福建源PTTSuV 1a型分子流行病学数据库奠定基础。