猪繁殖与呼吸综合征病毒促进猪链球菌2型感染猪肺泡巨噬细胞的初步研究

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对不同毒力猪链球菌2型(SS2)感染巨噬细胞的影响,本研究建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)的模型,实验分为4组:HA单独感染组(HA组)、PRRSV-HA共感染组(PRRSV-HA组)、T1/5单独感染组(T1/5组)和PRRSV-T1/5共感染组(PRRSV-T1/5组),利用该模型通过黏附试验、侵入试验和细胞内存活试验检测PRRSV对HA和T1/5黏附、侵入iPAM细胞及对该细胞存活率的影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测各感染组iPAM模型细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平。黏附试验结果显示,HA感染2 h后,PRRSV-HA组细菌对细胞的黏附水平极显著高于HA组(P<0.01或P<0.001);T1/5感染6 h后,PRRSV-T1/5组细菌对细胞的黏附水平极显著高于T1/5组(P<0.001),表明PRRSV与HA或T1/5共感染可以促进HA和T1/5对iPAM模型细胞的黏附,且HA对iPAM细胞的黏附水平高于T1/5。侵入试验结果显示,感染4 h后,共感染组细菌侵入iPAM细胞中的数量比单独感染组极显著增多(P<0.01或P<0.001)。细胞内存活试验结果显示,感染2 h后,共感染组细菌的存活率比单独感染组极显著升高(P<0.001)。荧光定量PCR试验结果显示,感染4 h时,共感染组iPAM细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平极显著高于单独感染组(P<0.001)。本研究首次建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染i PAM的模型,基于该模型研究首次发现PRRSV感染不仅促进了不同毒力SS2对i PAM细胞的黏附、侵入及SS2在iPAM细胞内的存活,还可以协同SS2显著提高该细胞中细胞因子的转录水平。本研究为进一步探究PRRSV和SS混合感染的机制提供了参考依据。

桑叶多糖对猪肺泡巨噬细胞的免疫调节作用

[目的]探究桑叶多糖(mulberry leaf polysaccharide,MLP)对猪肺泡巨噬细胞免疫功能的影响及其作用机制。[方法]以猪肺泡巨噬细胞为研究对象,通过CCK-8方法检测不同浓度MLP作用后猪肺泡巨噬细胞的增殖率,筛选MLP的适宜作用浓度。将细胞分成空白对照组(BC组)、阳性对照组(LPS组)和不同浓度MLP组,通过Griess法检测猪肺泡巨噬细胞中一氧化氮(NO)释放量;利用中性红吞噬试验检测猪肺泡巨噬细胞吞噬能力;使用ELISA法测定猪肺泡巨噬细胞中白细胞介素-10(IL-10)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;利用实时荧光定量PCR检测TNF-α、Toll样受体4(TLR4)、IL-6、IL-10以及核转录因子κB(NF-κB)的mRNA表达量;通过Western blotting检测猪肺泡巨噬细胞中TLR4和p65蛋白表达量。[结果]与0μg/mL MLP组相比,MLP浓度为20、40和80μg/mL时猪肺泡巨噬细胞增殖率极显著升高(P<0.01),且呈剂量依赖性,后续选择20、40和80μg/mL MLP进行试验。与BC组相比,不同浓度MLP组猪肺泡巨噬细胞吞噬率和NO释放量极显著升高(P<0.01)。ELISA检测结果显示,MLP浓度为80μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中IL-6和TNF-α含量显著或极显著高于BC组(P<0.05;P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,MLP浓度为40和80μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中TNF-α、IL-6和TLR 4基因mRNA表达量均极显著高于BC组(P<0.01)。Western blotting检测结果显示,MLP浓度为80μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中p65和TLR4蛋白表达量极显著高于BC组(P<0.01)。[结论]MLP能激活猪肺泡巨噬细胞,显著促进NO的释放以及IL-6、TNF-α的分泌,具有良好的免疫调节活性,其免疫调节机制与巨噬细胞表面TLR4的激活相关。

基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA,连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞,筛选单克隆细胞,结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定,进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21-SIRT3-KO),并以流感病毒A/WSN/33为研究对象,感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞,利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平,初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示,在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中,SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失,并导致移码突变;同时,利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达,结果显示与野生型细胞相比,3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白均不表达;流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现,敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系,并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。

呕吐毒素体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子和m^(6)A甲基化相关基因表达的影响

本实验构建了呕吐毒素(DON)体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞模型,研究DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子IL-6、IL-8和m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3、METTL14、FTO、WTAP和YTHDF2表达的影响。利用2μmol/L的DON刺激细胞24h和48h,收集不同时间点细胞样品的总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR检测炎性因子和m^(6)A修饰相关基因表达水平的变化,并利用蛋白免疫印迹法(WB)检测METTL3和FTO蛋白的表达水平变化。结果表明:2μmol/L的DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞24 h和48 h后,炎性细胞因子IL-6、IL-8的相对表达量均上调(P<0.01);与对照组相比,METTL3基因的mRNA转录水平均上调(P<0.05),FTO基因的mRNA转录水平均下调(P<0.05),METTL14基因仅在24 h后上调(P<0.05),而WTAP和YTHDF2基因在DON刺激细胞24 h和48 h后均无显著变化。蛋白免疫印迹分析结果显示,METTL3蛋白在48 h后上调(P<0.05),而FTO蛋白在24 h和48 h均下调(P<0.05)。以上结果表明,DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞可引起细胞内炎性因子的表达增加,且m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3的上调和FTO的下调可能与细胞炎症相关。此外,对DON组小鼠腹腔注射5 mg/kg BW DON,对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液。3 h后检测小鼠肺脏组织中m^(6)A甲基化修饰相关基因的表达情况,与对照组相比,肺脏组织中m^(6)A甲基化相关基因METTTL3、METTL14、WTAP、YTHDF2均无显著差异;FTO下调(P<0.001)。蛋白免疫印迹分析结果显示:在DON刺激小鼠3h后FTO蛋白下调(P<0.01),表明DON在动物体内也表现出相似的效应。

黄芩苷对多杀性巴氏杆菌感染猪巨噬细胞后炎症因子表达及信号通路影响的研究

为研究不同浓度黄芩苷对多杀性巴氏杆菌(Pm)HN-13株感染的猪巨噬细胞(HD11)内炎症因子表达的影响及与炎症信号通路的相互作用关系,本研究采用western blot检测HN-13株感染(0、30 min、60 min、90 min)HD11细胞中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路3个关键蛋白(p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK)的表达水平;采用ELISA和荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)分析检测低浓度剂量黄芩苷(L组,20μmol/L)、中浓度剂量黄芩苷(M组,40μmol/L)和高浓度剂量黄芩苷(H组,60μmol/L)对Pm感染的猪巨噬细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平及其m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)和模型组(HN-13);利用抑制剂SCH772984阻断ERK通路,采用ELISA和RT-qPCR检测黄岑苷对Pm感染的HD11细胞内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达及m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)、模型组(HN-13)、抑制组(HN-13+抑制剂)。结果显示:与HN-13株处理0 min组相比,随着感染时间的延长,HN-13株感染HD11细胞中p-ERK/ERK的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01),而p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达量均未发生显著变化(P>0.05),表明,HN-13株可使HD11细胞炎症相关ERK通路蛋白表达增强,且与作用时间呈正相关。与模型组(HN-13)相比,3个浓度剂量的黄芩苷均显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平及m RNA转录水平(P<0.05),且抑制作用随着黄芩苷浓度升高而增强。与抑制组相比,黄芩苷与抑制剂共处理组可以显著抑制HN-13感染的HD11细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及m RNA转录水平(P<0.05)。综上所述,黄芩苷可以抑制Pm感染的HD11细胞中ERK通路相关蛋白的表达和分泌,进而发挥抗炎作用。本研究为研制防治Pm引起的猪肺疫的新药提供了思路。

IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路增强小鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响及其相关机制。方法 脂多糖(LPS)经气道滴入激发构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6的含量。体外培养MH-S细胞,在信号转导子与转录激活子3 (STAT3)抑制剂Stattic(5μmol/L)存在与否的情况下,再加入IL-6(10 ng/mL~500 ng/mL)刺激6 h,加入荧光微球孵育2 h后,采用流式细胞术检测MH-S细胞吞噬荧光微球情况;Western blot法检测磷酸化的Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、肌动蛋白相关蛋白2(Arp2)、纤维型肌动蛋白(F-actin)的表达水平。结果 鼻腔滴入LPS后,小鼠BALF中IL-6含量显著升高。随着IL-6刺激剂量的增加,MH-S细胞吞噬荧光微球的作用增强,Arp2、 F-actin蛋白的表达水平升高。100 ng/mL IL-6刺激MH-S细胞后,p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平升高。阻断MH-S细胞STAT3信号后,IL-6促进细胞吞噬的效应完全消失,IL-6诱导的Arp2、 F-actin蛋白表达增加被抑制。结论 IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路促进MH-S细胞Arp2、 F-actin蛋白的表达增强吞噬功能。

姜曲海猪肺泡巨噬细胞的分离培养与鉴定

通过冷PBS气管灌洗法分离培养姜曲海猪肺泡巨噬细胞(PAM),进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。从健康20日龄仔猪,分离得到PAM。以10%RPMI-1640培养液对PAM进行培养,观察细胞形态,用墨汁吞噬和免疫荧光检测了PAM的吞噬功能和纯度,比较冻存前和复苏后细胞的活率和细胞吞噬功能,以获得一批高纯度的PAM,用于猪体外呼吸道疾病发病机理的研究。

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞细胞因子IL-10、IL-12p40和IFN-γ mRNA转录的影响

用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞因子IL-10、IL-12p40和IFN-γ的mRNA转录水平的变化进行了定量分析。结果表明,IL-12p40 mRNA转录从攻毒后3 d开始显著上调(P<0.05),7 d达高峰,14 d开始下降,但仍显著高于对照组(P<0.05),28 d和42 d低于对照组;IL-10 mRNA在3 d显著上调(P<0.05),14 d达到转录高峰(P<0.01),之后逐渐下降,42 d接近对照组水平;IFN-γmRNA转录水平尽管在3 d和28 d时出现2次转录低峰1、4 d和42 d时出现2次高峰,但只在3 d和7 d差异显著(P<0.05)。由此表明,PRRSV和PCV2共感染可导致PAM细胞因子IL-12p40和IL-10 mRNA的转录在感染早期被激活,而IFN-γ mRNA转录则呈较复杂的动态变化,提示PRRSV和PCV2共感染猪PAM的免疫应答、免疫调节和抗感染功能均受到不同程度的影响。

PRRSV与PCV2体外共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫学功能的影响

制备猪肺泡巨噬细胞,分别接种PCV2、PRRSV、PCV2+PRRSV(先接种PCV2,12h后接种PRRSV)、PRRSV+PCV2(先接种PRRSV,12h后接种PCV2)、PRRSV/PCV2(同时接种)和对照组。接种后不同时间观察细胞病变(CPE),并用real-time PCR和IFA方法检测PRRSV和PCV2滴度,INF-α、INF-γ、TNF-α、IL-8和IL-10的mRNA。结果为:①PRRSV能在PAM中增殖,有CPE;PCV2在PAM中感染率较低,无CPE。②PRRSV对PCV2增殖无明显影响。PCV2先于或同时与PRRSV感染对PRRSV的复制具有抑制作用,而PCV2后于PPRSV感染,可促进PRRSV增殖。③PCV2单独感染PAM后能促进INF-α、INF-γ、IL-8和IL-10的大量表达,对TNF-α的表达量影响不大。④PCV2与PRRSV混合感染,尤其是PCV2后于PRRSV感染后,TNF-α、IL-8和IL-10的表达量与单感染组相比明显增加,而INF-γ的表达量明显受到抑制。实验结果表明,PCV2感染时间对PRRSV的增殖影响不同,PRRSV感染后如果再感染PCV2,可以明显促进PRRSV病毒增殖;两种病毒共同刺激了TNF-α、IL-8和IL-10的大量表达,抑制了抗病毒因子INF-γ的表达,从而可能抑制体液免疫和细胞免疫,加重了病理学免疫应答。

脂多糖对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β及TNF-α的影响

研究了脂多糖的浓度、刺激时间对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响。分别用不同浓度的脂多糖和不同的刺激时间处理猪肺泡巨噬细胞，收集细胞，提取RNA，用实时荧光定量PCR方法检测IL-1、TNF-αmRNA表达水平；同时收集培养上清，用ELISA检测试剂盒检测IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。结果表明，脂多糖浓度（1-1000ng／mL）对IL-1β、TNF-α影响显著（P％0．05）；刺激时间（1-24h）对IL-1β、TNF-α影响显著（P〈0．05），且蛋白的表达水平迟于mRNA的表达水平。脂多糖诱导猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α具有剂量、时间依赖性。

PCV2与PPV体外混合感染猪肺泡巨噬细胞对细胞因子的影响

通过PCV2与PPV混合感染猪肺泡巨噬细胞,探讨PCV2与PPV体外混合感染的致病机制。体外分离猪肺泡巨噬细胞(PAMs),分为PCV2、PPV、PCV2/PPV混合感染组和对照组,采用实时荧光定量PCR技术检测PAMs中PCV2与PPV病毒拷贝数及细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的mRNA转录水平的变化。结果表明,PPV能在PAMs中增殖,而PCV2在肺泡巨噬细胞中增殖效率较低;PCV2能促进PPV增殖;PPV单独感染PAMs后能促进IFN-γ和TNF-α的表达;PCV2单独感染PAMs后能促进IFN-γ的表达,并在感染早期促进TNF-α的表达;PCV2与PPV混合感染后能显著抑制IFN-γ的表达,在感染早期对TNF-α的促进作用高于PCV2单独感染组,并能短暂的刺激IL-10的过量表达。说明PCV2与PPV混合感染存在协同致病作用,两种病毒共同刺激了TNF-α和IL-10的大量表达,抑制了IFN-γ的表达。

猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究

通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),优化了PAM的纯化和冷冻保存方法,并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。结果表明:RPMI-1640培养液比DMEM培养液更适于PAM的培养和冷冻保存;巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明,贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度最高(P<0.05);用70%RPMI-1640+20%新生牛血清+10%DMSO的体系冷冻保存细胞密度为1×107个/mL的PAM可获得高达98.09%的存活率,冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P>0.05)。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈相关分子和共刺激分子的影响

采用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后不同时相猪肺泡巨噬细胞(PAM)中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DRI、i链和SLA-DM分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的mRNA转录动态进行了定量检测。结果表明,PRRSV感染后PAM的SLA-DR mRNA转录水平在3、7和14 d下调,低于对照组;感染后3 d,Ii链、SLA-DM和CD40的mRNA转录水平极显著下调(P<0.01);CD80和CD86mRNA转录水平也在感染后3 d明显下调(P<0.05)。用流式细胞术检测PAM表面的SLA-DR抗原的结果表明,在感染后3 d短暂上升,7 d之后一直低于对照组。由此说明,PRRSV感染早期对猪肺泡巨噬细胞的外源性抗原加工和递呈功能产生显著影响,导致其外源性抗原递呈功能下降,进而影响机体的体液免疫应答。

猪圆环病毒2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

通过PCV2病毒感染3D4/21猪肺泡巨噬细胞后炎症相关细胞因子mRNA转录水平变化,探讨PCV2感染后可能的致病途径。通过PCV2病毒体外接种3D4/21细胞,感染不同时间后,收集样品,采用荧光定量PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-8及IL-18mRNA转录水平的变化。结果显示PCV2对3D4/21细胞的IL-1β、IL-8转录主要起抑制作用,对IL-8转录起促进作用。推测其在体内的综合效应导致感染早期机体抗病毒能力降低,引起机体免疫抑制,影响机体特异性免疫应答的正常运转,为PCVD的发病创造了条件。

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞生物学活性的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测PAM凋亡现象,通过EA花环试验测定Fc受体数目,通过吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,分析PCV2感染对PAM生物学活性的影响。结果显示,在整个试验期内2种方法均没有检测到PAM凋亡,表明PCV2感染不会诱发PAM凋亡。PAM的Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后第3 d明显下降,第7 d有所回升,之后基本恢复,表明PCV2感染后PAM吞噬和清除病原的功能出现短暂下降。

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。

猪圆环病毒2型感染仔猪肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA转录的变化

选用6头经ELISA和荧光定量PCR方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体和抗原均为阴性的普通断奶仔猪,无菌分离肺泡巨噬细胞(AMs),分为对照组和PCV2感染组(PCV2组)进行体外培养,分别在培养0、6、12、24和48h收集AMs。间接免疫荧光法定位检测PCV2感染AMs情况;荧光定量PCR方法检测TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9 mRNA转录量的变化。结果表明,TLR2mRNA的转录量在感染后6h迅速升高,12h后又迅速下降,但仍显著高于对照组(P<0.01或P<0.05),到48h时恢复;TLR3mRNA的转录量,攻毒后6和12h显著高于对照组(P<0.05),24和48h时恢复到对照组水平;PCV2明显升高感染后12hAMs中TLR4mRNA的转录(P<0.05),而明显抑制感染后24和48h的转录(P<0.05);PCV2引起感染后6和12h的AMs中TLR7、TLR8和TLR9mRNA转录量显著升高(P<0.01或P<0.05),而到感染后24和48h又恢复到对照组水平。结果表明,PCV2可显著影响体外培养仔猪AMs TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9mRNA的转录。

副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖抗猪肺泡巨噬细胞吞噬能力的研究

为探讨荚膜多糖在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)抗猪肺泡巨噬细胞吞噬中的作用,作者用间接免疫荧光试验和流式细胞术对H.parasuis SC096分离株及其荚膜缺陷型菌株进行了抗巨噬细胞吞噬试验。间接免疫荧光试验显示野生菌株组的H.parasuis大多数存在于巨噬细胞外,而荚膜多糖缺失突变体则主要存在于巨噬细胞内。流式细胞仪检测结果表明,对应的野生型菌株组巨噬细胞总的吞噬率为12.51%,吞入效率为89.61%;而荚膜多糖缺陷型组巨噬细胞总的吞噬率为27.18%,吞入效率为91.06%。加入外源荚膜多糖后,野生型菌株组巨噬细胞总的吞噬率降为2.72%,吞入效率降为32.72%;荚膜多糖缺陷型组巨噬细胞总的吞噬率降为3.59%,吞入效率基本不变,为91.36%。荚膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬细胞吞噬能力降低,表明H.parasuis SC096株荚膜多糖具有抑制巨噬细胞吞噬能力的作用。

猪链球菌2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

为探明猪链球菌2型(SS2)感染的致病机制,利用荧光定量PCR方法,分析不同SS2菌株对3D4/21猪肺泡巨噬细胞各炎症相关细胞因子mRNA体外转录水平的影响。结果显示强毒菌株ZY05719刺激细胞因子转录水平高于其impdh缺失株ZY05719(Δimpdh)和无毒菌株HA0609及低毒菌株CS100322-1。ZY05719诱导多个细胞因子mRNA过度转录,包括IL-18、IL-8和IL-12等。除IL-10外,HA0609诱导其他细胞因子mRNA上调转录;而CS100322-1刺激后,绝大部分细胞因子mRNA处于稳定状态。不同毒力SS2菌株影响细胞因子mRNA转录,且这种影响具有时间上的依赖性。SS2具有调节炎性细胞因子转录的能力,其结果介导炎症反应及白细胞趋集于感染部位,这可能是SS2引起脑膜炎炎症特征的机制之一。

巨噬细胞在PM_(2.5)暴露肺泡气血屏障损伤过程中的作用研究

目的探究巨噬细胞在细颗粒物(fine particulate matter,PM_(2.5))暴露肺泡气血屏障损伤过程中的作用。方法将18只10周龄、体质量24~27 g的雄性BALB/C小鼠随机分为(n=6):对照组(气管滴注生理盐水)、PM_(2.5)低剂量组与PM_(2.5)高剂量组(在实验第1、4、7天气管滴注PM_(2.5)样品悬液,染毒浓度分别为1.8和16.2 mg/kg体质量),末次染毒24 h后检测PM_(2.5)暴露后小鼠肺组织病理改变、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总蛋白(total protein,TP)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)释放水平以及肺组织中F4/80蛋白表达水平,观察小鼠肺泡气血屏障的损伤效应及肺组织中巨噬细胞的浸润情况。以肺泡上皮细胞A549和血管内皮细胞EA.hy926构建体外肺泡气血屏障模型,结合THP-1巨噬细胞模型,将PM_(2.5)上清、巨噬细胞培养上清和PM_(2.5)-巨噬细胞培养上清分别与屏障模型孵育24 h,通过检测屏障模型跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance,TEER)、荧光素钠透过率和屏障细胞LDH释放情况,确认PM_(2.5)暴露诱导屏障受损过程中巨噬细胞的促进作用;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测PM_(2.5)暴露后巨噬细胞炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和IL-8的表达情况,探究巨噬细胞在PM_(2.5)暴露中炎性应激效应。结果PM_(2.5)暴露可引起小鼠肺组织损伤,且随染毒剂量增加,BALF中TP、LDH、AKP含量及肺组织中巨噬细胞数量随之增加,PM_(2.5)高剂量组与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。体外肺泡气血屏障模型暴露结果显示:与150、300μg/mL PM_(2.5)上清或巨噬细胞培养上清单独作用于屏障模型相比,将150、300μg/mL PM_(2.5)-巨噬细胞培养上清暴露于屏障后,屏障TEER显著降低(P<0.01),透过率显著增加(P<0.01),且300μg/mL PM_(2.5)-巨噬细胞上清处理的组别可以明显提高上皮和内皮屏障细胞LDH的释放(P<0.01)。150、300μg/mL PM_(2.5)刺激后巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达显著增加(P<0.01)。结论巨噬细胞促进PM_(2.5)引起的肺泡气血屏障功能损伤。