猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白,被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手,分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用,揭示Mhp引起炎性损伤的新机制,为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cells,PBECs)感染模型和猪体感染模型,通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法,分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定,构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时,设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭,通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中,通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因,后感染Mhp,利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法,明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变,主要组织病理表现为肺脏炎性损伤,同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后,体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明,Mhp可诱导肺脏炎性反应,抑制SPLUNC1表达。另一方面,体外PBECs中过表达SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少;siRNA干扰SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加,表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程,本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明:无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育,还是SPLUNC1抗体体内封闭,Mhp的体内外生长均未受影响;SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响;过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活,相反SPLUNC1 siRNA干扰后,可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附,而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达,维护宿主炎性平衡;与此同时,Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控,进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。

猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

关于我国种猪场猪肺炎支原体净化的思考

猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪肺炎支原体净化方案的经验与我国生猪养殖特殊性的分析,提出分群体、分阶段的“三步法”净化建议,并对我国猪肺炎支原体的净化提出了展望。

猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗体。试验通过分子克隆构建原核表达质粒pET21a-RuvA,经诱导表达和纯化获得RuvA M hp重组蛋白;免疫家兔制备抗RuvA M hp多克隆抗体,再利用间接ELISA和Western blot试验进行效价测定和特异性验证;利用凝胶迁移试验结合表面等离子共振技术分析RuvA M hp的DNA结合活性;利用凝胶迁移试验结合Western blot试验鉴定RuvA M hp的寡聚特性。结果显示:原核表达的RuvA M hp重组蛋白约为26 ku;制备的抗RuvA M hp多克隆抗体效价为1∶256000,且具有良好的特异性;RuvA M hp具有较强的DNA结合活性,对霍利迪连接体的亲和力高达624.4 pmol·L^(-1)(K D),并且主要以八聚体形式与其形成稳定复合物。通过RuvA M hp的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定,为后续探索RuvA调解同源重组介导猪肺炎支原体抗原变异的分子机制奠定了基础。

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

2022年中国南方部分地区猪肺炎支原体感染状况的调查与分析

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(EP)的原发性病原,可导致猪咳嗽、气喘、消瘦,并因猪的饲料转化率升高、日增重减少、出栏时间延长,从而使养殖成本大大增加,给养猪业造成重大经济损失。本研究旨在对中国南方部分地区猪肺炎支原体的感染状况进行调查与分析。从中国南方部分地区21个规模化种猪场定点采样,首先通过病原检测比较鼻拭子和喉拭子的采样效果,随后以简单随机抽样结合分层抽样确定各猪场样本量。共收集母猪喉拭子样品1478份,并将调查的猪群按胎次分为“0~1胎母猪”和“≥2胎母猪”,通过实时荧光定量PCR进行病原检测,通过多位点序列分型(MLST)结合保守的p36基因及非保守的p97和p146基因进行分子流行病学分析。检测结果表明,鼻拭子样品的检出率为16.67%,喉拭子样品的检出率为56.67%,且Ct值更低。猪肺炎支原体感染的场检出率为66.67%,但各场感染压力较小,检出率为1.39%~18.57%。其中“0~1胎母猪”检出率为10.05%;“≥2胎母猪”检出率为2.17%。分子流行病学结果显示,7个猪场的流行菌株均为同一序列类型(ST128),不同猪场间的流行菌株高度同源。对于猪肺炎支原体的病原学检测,喉拭子是比鼻拭子更灵敏且有效的活体样品类型,母猪胎次和生猪调运引种是规模化种猪场感染猪肺炎支原体的重要因素。本研究为猪肺炎支原体的防控和净化工作提供理论基础。

猪支原体肺炎的症状、治疗与防控措施

养猪业在畜牧经济增长和乡村振兴发展中起到了重要的支撑、促进作用。生猪规模化、集约化养殖背景下,猪支原体肺炎等疫病的发病率明显升高,不仅影响猪的生长发育,而且严重的会致死,进而造成巨大的经济损失。基于此,本文着重探讨了猪支原体肺炎的症状、治疗方法和防控措施,希望能够为临床诊治起到一定的参考作用。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。

猪支原体肺炎治疗方法分析

猪支原体肺炎是一种慢性呼吸道疾病,该病发病率高且分布较为广泛,对生猪健康有着严重威胁。为控制该疾病带来的影响,应全面了解猪支原体肺炎的致病机理与临床症状,并深度分析现有的治疗方法,加强对疾病的预防和治疗效果,保障生猪身体健康的同时,使养猪行业保持稳定发展。

非洲猪瘟背景下猪肺炎支原体防控措施探讨

【目的】探讨猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mph)在猪养殖业中的防控现状以及有效的防控措施,特别是在非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)流行的背景下,提出控制猪群支原体感染,维护猪群健康的重要性和必要性。【方法】通过文献综述,实地考查和综合分析,对猪肺炎支原体的防控现状进行了全面梳理。从资源分配不均、生物安全漏洞、治疗策略调整和养殖业经济损失等方面展开讨论,揭示了当前面临的挑战和问题。【结果】在研究过程中发现,猪肺炎支原体的防控受到非洲猪瘟等重大疫病的冲击,资源分配不均、生物安全漏洞、治疗策略调整等问题制约了防控效果。然而,采用完善的检测方案、有效的疫苗保护、合理的药物治疗和科学的饲养管理等措施可以有效降低猪肺炎支原体的传播风险,维护猪群的健康水平。【结论】在当前非洲猪瘟等重大疫病威胁下,维护猪群健康是确保养猪业可持续发展的关键所在。通过采取综合的防控策略,可以有效地降低猪肺炎支原体的传播风险,提高猪群的整体抗病能力,从而确保养猪业在多重威胁中稳健发展。

猪支原体肺炎临床症状及防治

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引起的慢性呼吸道传染病,该病可通过多种方式传播,易引起猪只之间的交叉感染。针对当前存在的问题,本文将为养猪业工作者提供有关猪支原体肺炎的理论内容,包括临床特征、流行病学特点、诊断方法和预防措施等方面。

猪支原体肺炎的诊断与防治措施

为降低猪支原体肺炎的发病率,对猪支原体肺炎诊断以及防治措施进行了分析。首先,介绍了猪支原体肺炎的病原学及其流行病学;其次,对该病的临床症状及病理剖检进行了分析,为该病的初步诊断提供依据;最后,提出了诊断方法及防治措施,以降低猪支原体肺炎的发病率及实现准确诊断与科学治疗,带动猪养殖产业实现更好地发展。

猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法的建立和应用

目的:建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法。方法:选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象,针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针,建立猪支原体肺炎RT-PCR检测反应体系,并对其灵敏度、特异性、重复性进行分析及临床样本验证。结果:RT-PCR检测灵敏度为10^(2)拷贝、与PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等无交叉反应,批内和批间变异系数均小于2.00%,肺组织样本检出阳性数26例(86.67%),鼻拭子样本检出阳性数19例(63.33%)。结论:该研究成功建立了一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法,具有较高的检测灵敏度和特异性,重复性能良好,这为后期MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。

中药方剂治疗猪支原体肺炎的效果与推广应用

引言猪支原体肺炎是一种严重影响猪养殖业的传染性疾病,它引发的疫情不仅对养猪业造成了巨大的经济损失,还对食品供应链和公共卫生产生了潜在的威胁。尽管传统抗生素治疗在一定程度上控制了猪支原体肺炎的传播,但抗生素滥用引发的抗药性和环境问题使得寻求替代疗法成为当务之急。

猪肺炎支原体SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速高效的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物(SX4),建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。该方法可特异性检测Mhp,对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌4型及链球菌2型等病原均无特异性扩增;最佳引物SX4检测的灵敏度可达4.9×10^(1) copies/μL,组内和组间变异系数均小于2%。该方法可稳定检测出工艺生产抗原和市售疫苗中的Mhp菌量。试验表明,本研究成功建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法,其特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于Mhp疫苗抗原生产和临床疫苗中的Mhp菌量检测。

猪支原体肺炎的诊断及防控

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体感染所导致的慢性呼吸道疾病,以非持续性的干咳为主要症状,发病率高、死亡率低。因猪肺炎支原体感染造成的呼吸道黏膜屏障破坏及免疫抑制,猪群易与呼吸道病原混合感染而导致地方流行性肺炎。本病与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型及和猪流感病毒等疾病并发或混感时又被统称为“猪呼吸道复合征”,给世界养猪业带来巨大经济损失。本文主要就猪支原体肺炎的诊断技术及防控进行阐述,以期为科学有效防控该病提供参考。

猪支原体肺炎对猪场的危害及防控措施

猪肺炎支原体是引发支原体肺炎的重要致病原,该病原具备较强的传染性、危害性以及致死率,严重影响猪的健康和养殖效益,不利于养猪业稳定有序发展。因此积极做好防控工作意义重大。基于此,本文关于猪支原体肺炎对猪场的危害及防控措施进行了探究。

不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力对比实验

本研究旨在评价不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫攻毒保护效果。选择4周龄仔猪25头,随机分为5组,每组5头猪,分别免疫四种猪肺炎支原体灭活疫苗(即疫苗A组、疫苗B组、疫苗C组、疫苗D组),E组为攻毒对照组,不做任何处理,在同等条件下隔离饲养。各疫苗按照对应的说明书进行免疫,免疫后第14、28天进行采血,检测支原体抗体水平,一免后28 d时,所有免疫组连同攻毒对照组,各气管注射猪肺炎支原体CJ株5 m L/头(含0.01 g肺组织毒)。攻毒后饲养观察28 d,对所有实验组动物进行观察临床症状。A组实验动物攻毒后未出现咳嗽、腹式呼吸等支原体临床症状,B-D组实验猪攻毒后偶尔出现轻微间隔性咳嗽,E组实验动物攻毒后出现连续性咳嗽,个别猪出现腹式呼吸等临床症状。攻毒后第28天进行病理剖检。结果表明,攻毒对照组猪4/5头出现典型猪肺炎支原体病变,在肺脏尖叶、心叶、膈叶前1/3部位以及中间叶,出现“肉样”或“胰样”实质样病变,界限明显。B~D组解剖后个别猪出现典型猪肺炎支原体病变,A组实验动物解剖后个别猪肺脏出现零星病变,剩余实验动物肺脏均未出现猪肺炎支原体病变。根据肺部病变较少率计算,A~D组病变率分别为71.4%、42.8%、60.7%、44.6%。实验表明,4种猪肺炎支原体灭活疫苗均具有保护效果,但A组灭活疫苗与其他免疫组相比较,免疫效果明显优于其他免疫组,在猪群免疫中能够起到更好的免疫效果。