猪支原体肺炎活疫苗（168株）气溶胶免疫后呼吸道sIgA分泌及抗原存留规律

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae ,Mhp)引起的猪的一种慢性呼吸道疾病,严重影响养猪业发展,活疫苗气溶胶免疫是防治该病的新措施。为研究猪肺炎支原体活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,疫苗株在免疫猪肺内的占位存留规律,选用3周龄不吃初乳猪27头,随机分为3组,G1气溶胶免疫组12头,G2肺内免疫组12头,同时设立阴性对照3头。分别于免疫后第2 h、7 d、14 d及28 d进行鼻拭子Mhp sIgA检测以及血清抗体检测。另外在上述时间点分别宰杀G1和G2组各3头,对照组在实验组免疫后第28 d宰杀,采集肺泡灌洗液,分别进行Mhp sIgA检测及Mhp疫苗株含量检测。结果显示:(1)所有试验猪至实验结束,Mhp血清抗体未出现转阳现象;(2)鼻拭子sIgA水平G1组在免疫后第14 d与对照组相比上升,差异具有显著统计学意义(p <0.05);G2组在免疫后第7 d和14 d与相应的对照组相比上升,差异具有显著统计学意义(p <0.05),各时间点G1组与G2组sIgA水平差异不具备统计学意义(p >0.05);(3)G1组肺泡灌洗液中的 sIgA在免疫后14 d部分转阳(阳性率33.33%),28 d全部转阳(阳性率100%);G2组在免疫14 d时已全部转阳(阳性率100%),各时间点G1组与G2组sIgA水平差异不具备统计学意义(p >0.05);(4)气溶胶免疫组肺泡灌洗液内Mhp疫苗株浓度在免疫后第2 h、7 d、14 d和28 d分别是相应肺内免疫组的0.37倍、1.01倍、0.88倍以及0.52倍。猪支原体肺炎活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,和肺内免疫一样可以诱导免疫猪的局部黏膜免疫以及具有同等的占位效应,且经气溶胶免疫的疫苗株在免疫仔猪体内的增殖水平可能与其诱导的黏膜免疫水平相关。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)滴鼻免疫保护效果的研究

本研究通过滴鼻免疫新途径免疫猪支原体肺炎活疫苗168株,与肺内免疫组及对照组进行比较,来确定滴鼻免疫猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫保护力。将20只猪随机分为肺内免疫组、滴鼻免疫组、健康对照组和攻毒对照组。定期观察和检测各组猪免疫后的临床症状。结果表明:滴鼻免疫组免疫后,猪群体温正常,无免疫引起的局部或全身不良反应,免疫途径安全可行;滴鼻免疫组和肺内免疫组与健康对照组相比,SIgA水平显著升高,差异极显著(P<0.01),但滴鼻免疫组与肺内免疫组相比,差异不显著。流式细胞仪检测显示CD4+数值未发生显著性变化。肺脏剖检评分显示滴鼻免疫组的肺脏的病变水平与攻毒对照组相比呈极显著降低(P<0.01),保护率达到60%,相对低于肺内免疫组100%的保护率。猪支原体肺炎活疫苗(168株)通过滴鼻免疫方式,可以产生较好的免疫保护力。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)肺内免疫机制研究

为研究猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫机制,通过肺内接种免疫5～10日龄仔猪,并于免疫后不同时间点检测血清中IgG抗体效价、全血中淋巴细胞转化效率、呼吸道局部的IFN-γ浓度和特异性SIgA滴度,于免疫后28 d剖杀采集呼吸道上皮组织,通过扫描电镜法与原位杂交检测法观察疫苗株在呼吸道的存留以及对纤毛的影响情况。结果发现,免疫后猪血液中淋巴细胞转化增强1.52～2.01倍,支气管表面IFN-γ浓度和特异性SIgA滴度持续增加,但血清抗体一直未检测到。扫描电镜与原位杂交检测结果发现疫苗株能有效地黏附在支气管纤毛上皮细胞上,但对纤毛的影响较小。由此表明,猪支原体肺炎活疫苗(168株)通过肺内免疫可有效激活全身细胞免疫及呼吸道局部的黏膜免疫与细胞免疫反应,而且还可以通过黏附支气管纤毛上皮细胞产生占位效应而对上皮组织不产生损伤。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫效力研究

研究使用健康易感仔猪对3批猪支原体肺炎活疫苗(168株)分别进行了免疫效力试验、免疫期试验、临床效力试验、同类制品的免疫效力比较试验和免疫期比较试验,以及5批疫苗免疫商品猪的临床试验。结果表明:猪支原体肺炎活疫苗(168株)免疫仔猪60 d后,免疫组有80%以上的保护率,免疫后7个月,试验组仍有50%以上的保护率;同类制品免疫效力和免疫期比较试验结果表明两种猪支原体活疫苗差异不明显。临床观察和病理剖检结果表明免疫保护率在85%以上。以上结果都说明猪支原体肺炎活疫苗(168株)具有很好的免疫效力。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)的安全性研究

用健康易感仔猪进行同群感染试验和连续五代返强试验对猪肺炎支原体活疫苗(168株)进行安全性试验,同时也进行了该活疫苗单剂量、单剂量重复和大剂量试验及5批次疫苗免疫商品猪的临床试验。结果发现,猪支原体肺炎活疫苗(168株)免疫猪后,免疫猪和同群感染猪均未观察到典型的临床症状和病理变化;连续五代返强试验,试验猪均未观察到典型的临床症状和病理变化,说明该疫苗株未出现返强。单剂量、单剂量重复和大剂量试验及5批次疫苗的临床试验也未观察到不良反应。这说明受试批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)具有良好的安全性。

猪支原体肺炎灭活疫苗的临床应用对比研究

为了评估5种市售的猪支原体肺炎(MPS)灭活疫苗的临床免疫效果,试验将规模猪场300头3日龄体重接近的仔猪随机分为5个免疫接种疫苗组[以猪肺炎支原体(Mhp)J株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗A组,以P-5722-3株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗B组,以P-5722-3株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗C组,以SY株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗D组,以NJ株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗E组]和1个对照组,所有猪只于3,30,90,120,150日龄采血,175日龄解剖观察测定肺脏病变情况并进行Mhp抗原检测;测定猪群的体重、平均日增重、Mhp血清抗体水平、肺脏病变评分和肺组织Mhp阳性率,评价5种MPS灭活疫苗的临床免疫效果。结果表明:各疫苗组出栏重和平均日增重均较对照组有提高,其中3~27日龄仔猪阶段,D组平均日增重显著高于对照组(P<0.05);疫苗组较对照组肺脏病变程度减轻,降低幅度为8.3%~38.8%,其中D组降低幅度最大。各疫苗组之间Mhp阳性感染率差异不显著(P>0.05),A、C、D组猪只Mhp阳性感染率低于对照组,D组最低(为68.0%);3日龄开始,各组试验猪Mhp抗体水平呈下降趋势,至120日龄时降至最低。150日龄时,除D组Mhp抗体阳性率为0外,其他各组均出现Mhp抗体转阳的情况。说明5种疫苗对防止猪群感染Mhp或减轻症状具有不同程度的效果,其中D组MPS灭活苗(SY株)免疫效果更好,能显著提高仔猪的生长性能,减轻肺脏损伤。

不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对,分析3种疫苗菌株和4个标准株之间核苷酸及氨基酸差异。结果发现,疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%,与J株、232株相似性为99.1%,与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%;而与疫苗株168株相似性为97.5%;三个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%,差异主要发生在R1区重复序列的次数上。本研究为临床猪支原体肺炎活疫苗菌株的检测及不同菌株之间的差异鉴定研究奠定了基础。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术研究

肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻,是疫苗规模化生产的工艺难题。本文针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术进行研究。通过培养试验筛选四种培养基配方表明该疫苗株在低血清改良培养基中生长良好;优化发酵培养工艺,使其在发酵罐培养60～70 h的峰值可达到1010CCU/mL;设计筛选该疫苗耐热保护剂和冻干工艺,37℃下保存10 d的耐老化试验结果显示,下降滴度小于100.5CCU/mL。本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。

猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)的最小免疫剂量测定及活菌滴度与免疫保护率平行关系试验

为确定猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)的最小免疫剂量,使用两批该疫苗(活菌滴度均为108CCU/m L)分别用原倍、10倍、100倍和1000倍稀释,以胸腔注射和鼻腔接种两种方式各免疫4头仔猪,45 d后攻毒,70 d后剖杀观察结果。结果表明其中一批疫苗4个稀释度胸腔注射组的攻毒保护率分别为78%、77.6%、68.8%和55.2%,鼻腔接种组分别为70.6%、68.1%、58.4%和18.4%;另一批的胸腔注射组攻毒保护率分别为80.6%、78.8%、67.6%和52.4%,鼻腔接种组分别为71.6%、68.4%、53.5%和28.4%。按照判定标准,可将该疫苗的胸腔注射接种最小免疫剂量确定为106CCU/头,鼻腔接种最小免疫剂量确定107CCU/头,同时结果也证明免疫保护率与活菌滴度间在测定范围内具有很好的平行关系。

不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力对比实验

本研究旨在评价不同厂家猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫攻毒保护效果。选择4周龄仔猪25头,随机分为5组,每组5头猪,分别免疫四种猪肺炎支原体灭活疫苗(即疫苗A组、疫苗B组、疫苗C组、疫苗D组),E组为攻毒对照组,不做任何处理,在同等条件下隔离饲养。各疫苗按照对应的说明书进行免疫,免疫后第14、28天进行采血,检测支原体抗体水平,一免后28 d时,所有免疫组连同攻毒对照组,各气管注射猪肺炎支原体CJ株5 m L/头(含0.01 g肺组织毒)。攻毒后饲养观察28 d,对所有实验组动物进行观察临床症状。A组实验动物攻毒后未出现咳嗽、腹式呼吸等支原体临床症状,B-D组实验猪攻毒后偶尔出现轻微间隔性咳嗽,E组实验动物攻毒后出现连续性咳嗽,个别猪出现腹式呼吸等临床症状。攻毒后第28天进行病理剖检。结果表明,攻毒对照组猪4/5头出现典型猪肺炎支原体病变,在肺脏尖叶、心叶、膈叶前1/3部位以及中间叶,出现“肉样”或“胰样”实质样病变,界限明显。B~D组解剖后个别猪出现典型猪肺炎支原体病变,A组实验动物解剖后个别猪肺脏出现零星病变,剩余实验动物肺脏均未出现猪肺炎支原体病变。根据肺部病变较少率计算,A~D组病变率分别为71.4%、42.8%、60.7%、44.6%。实验表明,4种猪肺炎支原体灭活疫苗均具有保护效果,但A组灭活疫苗与其他免疫组相比较,免疫效果明显优于其他免疫组,在猪群免疫中能够起到更好的免疫效果。

猪支原体肺炎(168株)活疫苗的作用机理与应用

猪支原体肺炎（168株）活疫苗是由江苏省农业科学院兽医研究所和南京天邦生物科技有限公司共同研制申报．经农业部兽用生物制品规程委员会审查通过的国家二类新兽药。现笔者将其作用机理与应用简述如下。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产关键(环节)质量控制

文章针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产用菌种的扩繁与鉴定、原辅材料、生产流程的优化、成品检验4个环节进行阐述,并根据实际情况提出内控标准,关键指标高于国家标准10倍,实现对猪支原体肺炎活疫苗(168株)的批量生产,使产品的稳定性及可靠性得到大幅度提升。

猪支原体肺炎活疫苗（168株）肺内免疫机制研究

为研究猪支原体肺炎活疫苗（168株）的免疫机制，通过肺内接种免疫5～10日龄仔猪，并于免疫后不同时间点检测血清中IgG抗体效价、全血中淋巴细胞转化效率、

猪肺炎支原体168株弱毒活疫苗的应用

猪气喘病是由猪肺炎支原体（Mhp）引起的一种发病率高、死亡率低的传染病，主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难等症状，常会造成猪只生长发育迟缓、饲料转化率降低，加剧猪呼吸道疾病发病概率，导致上市时间延迟，给猪场带来严重的经济损失。

国家二类新兽药猪支原体肺炎（168株）活疫苗

猪支原体肺炎（168株）活疫苗是由江苏省农科院兽医研究所和南京天邦生物科技有限公司研制申报，经农业部兽用生物制品规程委员会审查通过，2006年3月14日被批准为国家二类新兽药【证号：（2007）新兽药证字10号】。猪支原体肺炎（168株）活疫苗的研制是三代研究人员智慧与汗水的结晶，实现了多项重大技术突破。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。

不同水性及水包油型佐剂对猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫增强作用

旨在为猪支原体肺炎灭活疫苗研发水性的或水包油型佐剂,降低疫苗的副作用。利用小鼠为模型动物评价几种不同佐剂配合猪支原体肺炎灭活疫苗免疫动物时对细胞免疫和体液免疫应答的增强作用。将不同佐剂与灭活疫苗配合肌肉注射免疫小鼠,检测脾淋巴细胞对猪肺炎支原体抗原的增殖应答情况及特异性的血清IgG抗体水平。试验分两批次进行,共评价11种佐剂。结果表明,卡波姆974+免疫刺激复合物基质混合物佐剂和壳聚糖+左旋咪唑混合物佐剂强烈地诱导产生高水平细胞免疫和体液免疫应答(P<0.01);卡波姆974+左旋咪唑混合物佐剂、卡波姆974+左旋咪唑+黄芪多糖混合物佐剂和ISA 11R VG佐剂次之(P<0.05);β-葡聚糖+左旋咪唑混合物佐剂、DEAE-dextran+左旋咪唑+黄芪多糖混合物佐剂和β-葡聚糖+左旋咪唑+黄芪多糖混合物佐剂在细胞免疫应答方面作用显著(P<0.01),但体液免疫应答作用稍弱;而GEL 01ST佐剂在体液免疫应答方面作用显著(P<0.01),细胞免疫应答作用稍弱。通过分析认为卡波姆974+免疫刺激复合物基质混合物佐剂、壳聚糖+左旋咪唑混合物佐剂的效果最好,可同时显著增加细胞及体液免疫应答,本试验结果将为猪支原体肺炎灭活疫苗的佐剂研发提供数据基础。

几种佐剂对猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫增强作用比较

为研发和评价猪支原体肺炎(MPS)灭活疫苗新型佐剂,本研究以水包油乳剂或水性高分子聚合物卡波姆佐剂为基础的MPS灭活疫苗,在其中分别添加左旋咪唑、黄芪多糖、免疫刺激复合物基质(ISCOM-matirx)或胸腺肽,得到不同的佐剂配方,同时选用3种商品化佐剂进行同步试验评价。将这些佐剂与MPS灭活疫苗合用免疫小鼠,检测淋巴细胞增殖情况及血清抗体IgG水平,用以比较几种佐剂对该疫苗中的免疫增强效果。结果表明,与对照组相比,各佐剂组均有明显免疫应答反应。其中,卡波姆+ISCOM-matrix佐剂组对增强小鼠淋巴细胞增殖能力及血清中抗体水平为各组间最高,其次为卡波姆+左旋咪唑佐剂组;GEL 01 ST佐剂能够增强疫苗的细胞免疫刺激能力,而对体液免疫作用稍差,卡波姆+胸腺肽佐剂组的血清抗体水平较高,但对淋巴细胞增殖没有明显作用。本实验结果将为后续的MPS灭活疫苗的研发提供了实验依据。

几种佐剂对肌肉注射猪支原体肺炎活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强现有猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力以实现肌肉注射免疫,向现有活疫苗中添加几种不同佐剂,考察其经肌肉免疫后机体的免疫应答情况。结果表明,免疫刺激复合物基质佐剂和左旋咪唑+壳聚糖混合佐剂能有效激发细胞免疫应答和体液免疫应答;左旋咪唑+黄芪多糖混合佐剂能增强疫苗的细胞免疫刺激能力,而对体液免疫无作用;皂角素佐剂未显示明显的免疫增强效果。本试验结果为肌肉注射猪支原体肺炎活疫苗的开发奠定了数据基础。