胞内劳森菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪胞内劳森菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,针对胞内劳森菌的16SrDNA基因设计合成特异性的引物和TaqMan探针,经过优化各项反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法仅对胞内劳森菌靶基因有信号,其相关性方程为Ct=-3.318×log(conc)+38.840(R2=0.998),具有良好的线性关系,对标准质粒最低检出量为5.55copies·μL-1,组内样品的变异系数低于2%。表明该TaqMan荧光定量PCR方法的特异性强、敏感度高、重复性好,具有较好的实用性,能准确定量DNA样品中靶基因的拷贝数,适合于对临床样品中胞内劳森菌定性、定量检测和防治效果的评价。

猪胞内劳森菌定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立用于检测导致猪增生性肠炎（PPE）的胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）的荧光定量PCR方法,依据Gen Bank中登录的LI基因组asp A序列,应用分子生物学软件优化设计1对特异性引物,经PCR扩增出300 bp的目的片段。产物经回收与p MD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示：建立的检测方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,r2=0.997 9,产物TM在85.0~85.3℃之间,灵敏度为17.5个拷贝/μL,特异性和重复性较好,可用于临床PPE的诊断。本试验成功建立了检测PPE的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为LI的早期鉴别诊断以及PPE的致病机理研究提供了技术支持,也为PPE分子诊断试剂盒的研制奠定了技术基础。