双功能化无机介孔材料对猪胰蛋白酶催化性能的影响

通过在SBA-15介孔材料表面引入带有不同官能团及不同亲疏水性质的修饰剂(-SH,-Cl,-NH_2,-C_1,-C_3,-C_8及-C_(16)),改善介孔材料与猪胰蛋白酶的结合力及蛋白酶所处微环境,从而提高酶固定化效率,活性及其稳定性。结果表明,官能团修饰后载体固定化酶PT-NH2/C8-SBA活性达到255 U/mg胰蛋白,较之未修饰载体固定化酶PT-SBA活性(195 U/mg胰蛋白)有大幅度的提高;并且重复使用五次及在室温下保持5 d后,PT-NH_2/C_8-SBA活力仍然能保持初始活力的85%及81%。而PT-SBA仅仅保留了初始活性的51%及67%。固定化酶的酶学性质和催化反应动力学研究表明,底物与固定化酶PT-NH_2/C_8-SBA具有更好的亲和力,固定化酶PT-NH_2/C_8-SBA有较高的活力和稳定性。

重组猪胰蛋白酶原及其突变体在毕赤酵母X33中的组成型表达

目的:设计以PGAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪胰蛋白酶。结果:筛选到高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得了重组猪胰蛋白酶。结论:以PGAP为启动子的质粒,转化毕赤酵母X33后表达的重组猪胰蛋白酶原避免了补加甲醇带来的危害,且操作方便,大大缩短了周期,提高了生产效率,避免了动物源性污染。

聚乙二醇沉淀猪胰蛋白酶的研究

研究了从猪胰脏中用聚乙二醇(PEG)分离提取胰蛋白酶的条件。采用单因素实验考查了聚乙二醇分子量、聚乙二醇浓度、pH值和提取时间对胰蛋白酶活力的影响,并通过正交实验对提取工艺条件进行优化,在0.25g/mL聚乙二醇6000,pH7.5,4℃提取3 h条件下,胰蛋白酶酶活力达到1600 U/mL以上,比传统的盐析法提取率高,并且操作简单,是一种比较有效的分离猪胰蛋白酶的方法。

重组猪胰蛋白酶冻干制剂稳定性研究及在细胞培养中的应用

目的筛选重组猪胰蛋白酶(rPT)冻干保护剂和保存方法,及配制细胞消化液的稳定性及其应用。方法在rPT酶液中添加不同浓度不同种类的冻干保护剂,比较冷冻干燥后的活性保留率,并从赋型性、色泽度、溶解性方面评价冻干保护剂的作用;rPT酶液经过无菌过滤处理,内毒素含量检测合格后,冻干。然后配制成细胞消化液,优化细胞消化液组成,将细胞消化液应用于细胞培养。结果添加3%甘露醇和3%海藻糖的rPT冻干品的酶活性保留率分别为101%和86.5%;用PBS缓冲液配制细胞消化液(含有0.01%EDTA)消化贴壁细胞的综合效果最好,且保存在-20℃时稳定性较好。结论从冻干后酶活性保留率和冻干品外观评价,3%甘露醇可作为rPT冻干过程中的最佳保护剂;rPT细胞消化液应用在细胞培养中的成功,证明rPT可以替代提取的猪/牛胰蛋白酶使用,消除了动物源性病毒等外源因子的污染。

重组猪胰蛋白酶及其R122位点突变体在毕赤酵母中的高效表达及其性质研究

目的：研究R122位点突变重组猪胰蛋白酶,与野生型酶相比较,该位点对重组猪胰蛋白酶（RPT）性质的影响。方法：以毕赤酵母GS115作为表达宿主,对RPT、突变体mRPT（R122H）和mRPT（R122H/R73G/R130T）进行表达及纯化。并对其性质和稳定进行对比研究。结果：重组胰蛋白酶及其突变体在毕赤酵母中均获得了高效表达。相对于RPT,突变体mRPT（R122H）和mRPT（R122H/R73G/R130T）在以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物时,具有更强底物结合力,三者的米氏常数分别为18.8μmol/L、9.0μmol/L和11.0μmol/L;两突变体耐高温耐碱能力增强;在Ca2＋存在及去除的条件下,突变体具有更强的抗自降解能力。结论：可以利用毕赤酵母高效表达重组胰蛋白酶及其突变体。mRPT（R122H）和mRPT（R122H/R73G/R130T）相对于野生型RPT,对高p H条件和高温的耐受性增强,该稳定性的提高主要归因于R122位点的突变。

重组猪胰蛋白酶在制备狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)中的应用

目的探索重组猪胰蛋白酶(简称重组猪胰酶)在制备狂犬病疫苗[鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)]中的应用。方法采用SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定重组猪胰酶及猪胰酶;用1.25 mg/mL猪胰酶及1、0.25、0.0625、0.015625 mg/mL重组猪胰酶分别消化制备原代CEF,比较细胞活率、单胚细胞收获量、体外培养48 h的细胞增殖比及培养96 h的细胞形态,筛选最适重组猪胰酶工作浓度;用最适浓度重组猪胰酶及1.25 mg/mL猪胰酶消化后原代CEF对狂犬病病毒滴度的影响。结果重组猪胰酶仅有1条蛋白条带,纯度100%,而猪胰酶有多条蛋白杂带,纯度33%;与1.25 mg/mL猪胰酶比较,0.0625 mg/m L重组猪胰酶消化的CEF细胞活率、单胚细胞收获量及培养48 h的细胞增殖比差异均无统计学意义(P均>0.05),且其细胞形态相当,其最适工作浓度为0.0625 mg/mL;2种胰酶制备CEF的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组猪胰酶可代替猪胰酶用于狂犬病疫苗(CEF细胞)的生产。

不同胰蛋白酶在制备腮腺炎减毒活疫苗中的效果比较

目的比较基因重组胰蛋白酶和猪源胰蛋白酶在腮腺炎减毒活疫苗中的使用效果。方法使用浓度为10%、15%、20%基因重组胰蛋白酶制备鸡胚成纤维细胞,通过细胞密度、细胞活性、24 h以及48 h细胞贴壁状态等指标确定基因重组胰蛋白酶使用浓度;与猪源胰蛋白酶进行比较,通过细胞密度、细胞活性、48 h细胞贴壁状态以及病毒滴度等指标比较两种胰蛋白酶的使用效果;使用基因重组胰蛋白酶制备3批腮腺炎减毒活疫苗,检定疫苗的稳定性;规模化放大验证该工艺的稳定性。结果通过研究发现基因重组胰蛋白酶的使用浓度为15%;与猪源胰蛋白酶进行比较,两种胰酶制备的细胞密度水平一致,无显著性差异(P>0.05),48 h后细胞均生长至单层,细胞状态良好,按照同一MOI进行接毒,病毒滴度无显著性差异(P>0.05);使用CF-10进行试验,病毒滴度也无差异(P>0.05);连续3批使用基因重组胰蛋白酶制备的疫苗热稳定性良好,且该工艺可以规模化放大。结论在制备腮腺炎减毒活疫苗中可以使用浓度15%的基因重组胰蛋白酶替代猪源胰蛋白酶,作为鸡胚成纤维细胞消化液使用。

没食子酸对猪胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

以没食子酸为材料,通过考察酶质量浓度、反应体系中底物和酶及没食子酸添加顺序、不同反应时间、不同没食子酸质量浓度对猪胰α-淀粉酶、蛋白酶的活性影响,研究没食子酸对两种酶的抑制作用。结果表明,在底物质量浓度为1g/100mL、体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液37℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰α-淀粉酶活性最优条件为:α-淀粉酶质量浓度0.64mg/mL,反应时间15min,没食子酸对α-淀粉酶的最大抑制率为95.52%;在体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液40℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰蛋白酶活性的最优条件为:胰蛋白酶质量浓度0.63mg/mL,反应时间30min,没食子酸对胰蛋白酶的最大抑制率为99.24%。没食子酸对两种酶的抑制效果均随没食子酸质量浓度的增大而增强。

国产猪胰弹性蛋白酶联合氯化钙浸泡法构建兔腹主动脉瘤模型

目的采用国产猪胰弹性蛋白酶联合氯化钙浸泡法构建简便稳定的兔腹主动脉瘤(AAA)模型。方法 48只新西兰大白兔随机分为动脉瘤组、蛋白酶组、氯化钙组和假手术组。剖腹手术游离一段长约1 cm腹主动脉,动脉瘤组游离动脉段以氯化钙和国产猪胰弹性蛋白酶浸泡20 min,蛋白酶组、氯化钙组分别仅以猪胰弹性蛋白酶、氯化钙浸泡20 min,假手术组由0.9%氯化钠溶液浸泡20 min。术后5、15、30 d采用彩色超声检测浸泡段腹主动脉直径,术后5、30 d每组分别处死6只实验兔作组织病理学和免疫组织化学检查。结果动脉瘤组实验兔均形成AAA,蛋白酶组仅形成1例,氯化钙组、假手术组均未见形成。动脉瘤组与其余各组组织病理学比较,动脉内膜和中膜较薄,胶原纤维和弹力纤维含量减少且修复增生不明显,基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达和炎性细胞浸润均明显增强。术后5 d蛋白酶组、氯化钙组可见血管破坏,术后30 d蛋白酶组与动脉瘤组相比可见内膜增生明显,中膜厚度恢复至正常水平,胶原纤维、弹力纤维和平滑肌细胞含量增多明显,MMP-2、MMP-9表达和炎性细胞浸润明显减弱。结论国产猪胰弹性蛋白酶联合氯化钙浸泡法可构建简便稳定的兔AAA模型。

活性位点邻近的?-loop对胰蛋白酶热稳定性和活性的影响

以猪源胰蛋白酶作为研究对象,尝试利用删除猪源胰蛋白酶活性位点邻近?-loop的方法来提高其热稳定性和活性。首先通过Gromacs v4.5.5分子动力学模拟软件,预测出了胰蛋白酶的柔性区Fragment 41~46(即?-loop所在区域)。然后根据删除?-loop结构中不同的氨基酸数目,确立了三个突变R1Q、K3Q及C5Q;通过重叠延伸PCR技术构建突变菌株,发酵表达后,进行了酶热稳定性和活性分析。结果表明,R1Q、K3Q及C5Q的活性在一定程度上均有提高,在热稳定性上R1Q和K3Q有所提高,C5Q有所下降,其中R1Q突变体酶的最高活性较野生型提高了1.42倍,同时,失活半衰期和最适反应温度较野生型也分别提高了213.3 min和11.8℃。实验结果证明,在删除该?-loop中的异亮氨酸后,得到了突变型R1Q酶,成功实现酶双功能的共同进化。该策略有潜力应用于其他工业酶分子的热稳定性和活性改造,为推动生物酶的工业化应用奠定基础。

酶解猪血蛋白中活性肽的纯化和功能研究

利用层析、超滤等生物化学手段纯化猪血胰蛋白酶水解液 ,得到的目标产物是一种在高压液相色谱水平上的纯品 ,分子量大约为 3 0 0 0的小肽 .利用 T淋巴细胞转化实验和 E花环形成实验确定目标小肽的存在 ,并分别采用体内、体外的免疫学和药理学实验 ,初步确定了目标小肽对机体免疫活性的增强性质 .

重组猪源胰蛋白酶原的构建、表达与活性分析

目的:构建、表达重组猪源胰蛋白酶原,并对其进行分离纯化和酶活性分析。方法:利用大肠埃希菌表达系统(p ET-28a,宿主菌BL21DE3)优化天然猪源胰蛋白酶原基因,经乳糖诱导表达重组胰蛋白酶原蛋白,采用阴离子交换色谱法分离纯化,以SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白,以紫外分光光度法检测重组蛋白的酶活力。结果:测序结果表明,重组猪源胰蛋白酶原基因工程菌构建成功,SDS-PAGE检测显示目的蛋白条带位置与标准猪源胰蛋白酶条带位置一致,且酶活力可达513.09U·mg-1。结论:成功获得了重组猪源胰蛋白酶原,且酶活力较好,为进一步研究生产提供了基础。

改良腹主动脉瘤大鼠模型的制作方法

目的介绍一种改良腹主动脉腔内灌注猪胰蛋白酶(PPE)制作腹主动脉瘤(AAA)大鼠模型的方法。方法将20只SD大鼠随机为两组,分别是改良腹主动脉腔内灌注PPE组和传统腹主动脉腔内灌注PPE组,每组10只。通过超声测量腹主动脉直径,比较两组大鼠的手术相关指标,大鼠存活率,术后7、14d的AAA成瘤率和腹主动脉扩张率。通过弹性纤维染色和免疫组织化学染色(IHC)染色法观察腹主动脉弹性纤维情况和炎性细胞浸润情况。结果改良腹主动脉腔内灌注PPE组的手术时间明显短于传统腹主动脉腔内灌注PPE组,每只大鼠的PPE用量明显少于传统腹主动脉腔内灌注PPE组,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。术后14 d,两组的大鼠存活率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。术后7 d,改良腹主动脉腔内灌注PPE组的腹主动脉扩张率、AAA成瘤率均高于传统腹主动脉腔内灌注PPE组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);术后14 d,改良腹主动脉腔内灌注PPE组的腹主动脉扩张率明显高于传统腹主动脉腔内灌注PPE组,差异有统计学意义(P﹤0.01),但两组的AAA成瘤率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。改良腹主动脉腔内灌注PPE组大鼠AAA内弹性纤维含量明显低于传统腹主动脉腔内灌注PPE组,差异有统计学意义(P﹤0.01)。每个高倍镜视野下,两组大鼠AAA组织内的巨噬细胞数量比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论改良腹主动脉腔内灌注PPE制作AAA大鼠模型具有典型AAA病理特点,该模型制作方法具有成瘤率高、成瘤时间短的优点。

一种高效便捷的家兔肺气肿模型建立方法

目的应用猪胰蛋白酶气管注入同时联合木瓜蛋白酶静脉注射法来建立家兔肺气肿模型。方法将家兔随机分为模型组及对照组。模型组兔耳缘静脉注入8%木瓜蛋白酶同时5%猪胰蛋白酶气管注入制作模型。对照组:家兔经环甲膜穿刺一次性注入生理盐水1 ml/kg。再经家兔耳缘静脉一次性注入生理盐水1 ml/kg。观测实验动物动脉血气及肺功能,并对肺组织进行病理学观察。结果与正常对照组相比,模型组兔动脉血Pa CO2升高;而p H值、Pa O2、Sp O2降低;潮气量下降,呼吸总阻力、中心阻力、总气道阻力升高;病理组织切片光镜下见肺泡壁变薄、断裂,肺泡腔扩张、融合,典型肺气肿表现。结论应用猪胰蛋白酶气管注入同时联合木瓜蛋白酶静脉注射法能成功建立兔肺气肿模型。该方法快捷可靠,适用于各种肺气肿动物研究实验。

一种巨大腹主动脉瘤大鼠模型制作方法

目的 建立一种巨大腹主动脉瘤(GAAA)大鼠模型的制作方法。方法 以Sprague-Dawley大鼠为研究对象分为3组,分别为改良法腹主动脉腔内灌注猪胰蛋白酶(PPE)组(GAAA组),传统腹主动脉腔内灌注PPE组(传统AAA组)和生理盐水组,每组10只。超声检测腹主动脉直径并计算扩张率,扩张率大于150%视为腹主动脉瘤,大于400%视为GAAA。苏木精-伊红(HE)染色、弹力纤维(EVG)染色和免疫组织化学(IHC)染色鉴定腹主动脉平滑肌细胞、弹力纤维降解和炎症细胞浸润情况。结果大鼠均成功灌注PPE,随访期间无大鼠死亡。术后2周,GAAA组腹主动脉平均扩张率为424.82%±83.66%,其中70%(n=7)大鼠符合GAAA成瘤标准;传统AAA组腹主动脉平均扩张率为221.80%±34.66%,无大鼠符合GAAA成瘤标准。组织学结果示GAAA组内平滑肌细胞数量减少、弹力纤维明显降解和巨噬细胞浸润较传统AAA组更为明显。生理盐水组未出现腹主动脉瘤。结论 改良法腹主动脉腔内灌注PPE是一种制作GAAA大鼠模型的实验方法,该模型成瘤率高,具有与人GAAA相似的病理学特点。