一株高分化效率的永生化猪脂肪前体细胞系建立

[目的]本研究旨在获得可以稳定传代并且始终保持高分化效率的猪脂肪前体细胞系。[方法]采集1日龄约克夏仔猪背部皮下脂肪组织,分离原代猪皮下脂肪前体细胞(porcine subcutaneous preadipocytes,PSPA),利用过表达SV40T的慢病毒感染从而获得永生化的PSPA,进一步通过有限稀释法获得了107株单克隆细胞系,从中筛选出一株具有高分化效率的单克隆细胞系,命名为Pig#4。通过比较相近代数时Pig#4与永生化PSPA、3T3-L1小鼠脂肪前体细胞系的分化效率,验证单克隆细胞在高代数时的分化效率。[结果]Pig#4 PSPA细胞在高传代数(P30)仍具有与永生化的PSPA细胞系相似的外形特征和增殖能力,仍能保持与3T3-L1细胞系近似的分化效率。并且,相较于原代PSPA细胞,Pig#4 PSPA细胞具有更高表达分化与聚脂成熟相关基因的趋势。[结论]获得了1株可以稳定传代并保持高分化效率的永生化猪脂肪前体细胞系。

猪脂肪控制氧化及挥发性氧化产物研究

通过单因素试验和正交试验研究以热反应制备肉味香精前体物为目的的猪脂肪控制氧化工艺条件。以过氧化值(POV)、硫代巴比妥酸值(TBA)和酸值(AV)表征油脂的氧化状态。结果表明,猪脂肪控制氧化的较佳工艺条件为:反应温度120℃、反应时间2h、氧气流速0.025m3/h。采用固相微萃取-气质联用技术对猪脂肪控制氧化产物中的挥发性成分进行分析,共鉴定出32种化合物,其中醛类化合物占52.52%,为猪脂肪控制氧化产物中的主要挥发性成分。

大豆异黄酮抵抗体外培养猪脂肪细胞氧化损伤的作用

为了探明大豆异黄酮对猪脂肪细胞氧化损伤的保护效应,试验分别用含0、10、20、40μmol/L和80μmol/L异黄酮S(一种合成的大豆异黄酮)或三羟基异黄酮(GEN)的完全培养液培养猪脂肪细胞48h,用终浓度为100μmol/L的FeSO4和H2O2溶液进行氧化处理1 h。结果表明:与正常对照组相比,氧化对照组细胞内活性氧(ROS)水平和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量分别升高了1.61倍和2.74倍(P<0.01);与氧化对照组相比,添加10、20、40μmol/L和80μmol/L异黄酮S使细胞内ROS水平分别下降了24.62%(P<0.05)、20.03%(P<0.05)、37.88%(P<0.01)和41.20%(P<0.01);添加10、20、40μmol/L和80μmol/L GEN均显著降低了细胞内ROS水平(P<0.01)和MDA含量(P<0.05)。试验结果提示在本试验条件下,异黄酮S和GEN能通过抑制猪脂肪细胞的脂质过氧化、降低ROS产生,抵抗羟自由基对猪脂肪细胞的氧化损伤。

山羊抗猪脂肪细胞膜蛋白抗体的制备与ELISA鉴定

猪屠宰后 ,迅速采取其皮下脂肪在 37℃下的膜提取液中的匀浆 ,于 37℃温箱中孵育 30 min后 ,用差速离心法和高速离心法提取脂肪细胞膜蛋白 ,并作 SDS- PAGE电泳分析脂肪细胞膜蛋白与其它组织细胞膜蛋白的差异。从电泳图上看出 ,脂肪细胞有很多特异膜蛋白 ,也有一些与其它组织细胞膜蛋白相似的条带。膜蛋白与佐剂充分乳化后主动免疫 3只山羊 ,免疫后 70 d取血清 ,用 EL ISA检测抗体效价为 1:6 40 0。同样 ,用 EL ISA测定抗体与其它组织细胞膜的交叉反应 ,结果显示 :抗猪脂肪细胞膜抗体与其它组织细胞膜有交叉反应 ,但反应性不高。

猪脂肪诱导氧化过程及添加迷迭香精油的抗氧化活性

分析猪脂肪的氧化过程,绘制猪脂肪在90℃、高氧条件下的诱导氧化过程曲线,并就添加迷迭香精油的抗氧化活性进行分析。结果表明:添加0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/kg迷迭香精油和添加0.30 g/kg复合抗氧化剂(迷迭香精油0.25 g/kg+VE 0.05 g/kg)的猪脂肪,其氧化反应诱导时间分别为190、228、301、344、393、408、467、497 min,猪脂肪的氧化过程呈现明显的线性关系,在实验条件下,猪脂肪迅速发生氧化反应,迷迭香精油对猪脂肪的氧化作用具有一定的抑制作用,迷迭香精油对猪脂肪的抗氧化作用主要发生在氧化反应的前期,且抑制作用的大小与添加量存在显著的量效关系,同时复合抗氧化剂的作用效果优于单一抗氧化剂,说明不同抗氧化剂之间存在协同增效的作用。

抗猪脂肪细胞膜单链抗体基因的构建及鉴定

应用噬菌体展示技术,从猪脂肪细胞免疫的小鼠脾细胞mRNA中构建出单链抗体(scFv)cDNA文库。cDNA文库克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化E.coliTG1。通过噬菌体表面展示,用猪脂肪细胞对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行3轮亲和富集,筛选出了猪脂肪细胞膜scFv,为今后的应用奠定了基础。

瘦素(leptin)对猪脂肪细胞脂滴相关蛋白和脂肪生成相关酶mRNA表达的影响

以体外培养的猪原代脂肪细胞为研究对象,研究瘦素(leptin)对猪脂肪细胞脂滴相关蛋白(perilipin、ADRP、TIP47)和脂肪生成相关酶(FAS、SCDα、ACCα)mRNA表达的影响.用0、50、100、150nmol·L-1leptin分别处理脂肪细胞3、6 h,油红O染色鉴定,RT-PCR检测.结果表明,当用150 nmol·L-1leptin处理猪脂肪细胞3 h时perilipin mRNA表达显著降低,用50、100 nmol?L-1leptin处理3 h时PPARγ、ACCα、FASmRNA表达降低;当用50、100 nmol·L-1leptin处理猪脂肪细胞6 h时perilipin、SCDα、PPARγ、FAS、ACCα、LXRαmRNA表达降低,50、100、150 nmol·L-1leptin处理显著下调ADRPmRNA的表达,100、150 nmol·L-1leptin处理TIP47mRNA表达升高.以上结果提示,50、100 nmol·L-1leptin可能通过抑制PPARγ和LXRα来抑制perilipin、SCDα、FAS、ACCαmRNA的表达,从而调控猪原代培养脂肪细胞中的脂质代谢,而150 nmol·L-1leptin可能引起leptin的抵抗进而削弱leptin的调控作用.

添加抗氧化剂对猪脂肪的诱导氧化影响

研究添加不同抗氧化剂猪脂肪的诱导氧化性质,选取4种天然抗氧化剂、5种合成抗氧化剂和1种抗氧化剂增效剂进行分析,在高温(温度90℃)和高氧压力(氧气压力0.6 MPa)作用下,油脂会发生氧化反应,通过量化样品仓内氧气压力的变化来考察猪脂肪的诱导氧化进程,分别测定添加单一抗氧化剂的猪脂肪的氧化诱导期,并对部分抗氧化剂复配对诱导氧化性质的影响进行分析。结果表明:在国家标准限定的使用量下,添加不同抗氧化剂的诱导氧化时间依次为:丁基羟基茴香醚(b utyl hydroxy anisd,BHA)(45.12 h)>2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)(36.23 h)>没食子酸丙酯(21.35 h)>叔丁基对苯二酚(11.30 h)>抗坏血酸棕榈酸酯(8.03 h)>迷迭香精油(7.96 h)>甘草提取物(7.83 h)>茶多酚(tea polyphenols,TP)(5.58 h),单独添加维生素E(vitamin E,VE)(5.47 h)效果较弱;BHA与BHT的抗氧化效果均呈现线性关系;BHA与BHT、柠檬酸、TP和VE复配的诱导氧化时间具有不同程度的增加。

两种抗氧化剂协同增效剂对猪脂肪抗氧化性的影响

以过氧化值(POV)作为油脂稳定性的评价指标,采用Schaal烘箱实验法研究单一抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)对猪脂肪的抗氧化效果,BHA与异VC钠和BHA与柠檬酸两种增效剂复配组合对猪脂肪的抗氧化效果。结果表明,单一抗氧化剂对猪脂肪抗氧化效果强弱顺序依次为:BHA>BHT,异VC钠和柠檬酸均对抗氧化剂有协同增效作用,且柠檬酸的抗氧化协同增效作用优于异VC钠,复合抗氧化剂的抗氧化效果优于单一抗氧化剂。添加160mg/kg BHA、40mg/kg BHT、200mg/kg异VC钠、100mg/kg柠檬酸为最优组合。

白细胞介素-6对猪脂肪细胞脂肪分解的影响

为了研究白细胞介素(Interleukin,IL)-6对猪脂肪细胞脂肪分解的影响及其分子机制,分化的猪脂肪细胞用不同浓度的IL-6(0、25、50、75、100 ng.mL-1)处理24或48 h。通过测定培养液中的甘油浓度检测脂肪细胞的脂解率;采用形态学观察检测脂肪细胞中甘油三酯积聚量的变化;分别用RT-PCR和Western blot检测脂肪细胞中perilipin A、PPARγ2(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2)、HSL(Hormone-sensitive lipase)和AT-GL(Adipose triglyceride lipase)的mRNA及蛋白表达。结果显示,IL-6以剂量和时间依赖性的方式刺激猪脂肪细胞的脂肪分解,同时PPARγ2和perilipin A的mRNA及蛋白表达被显著下调;HSL的mRNA表达显著上调,但其蛋白表达水平并未发生显著改变;ATGL的mRNA和蛋白表达均未发生显著改变。上述研究结果表明,IL-6通过抑制PPARγ2及其靶基因perilipin A的表达直接刺激猪脂肪细胞的脂肪分解。

抗猪脂肪细胞膜蛋白抗体的制备及测定

猪屠宰后,立刻取其背部皮下脂肪组织在37℃膜萃取液中匀浆,用差速离心法和密度梯度离心法提取脂肪细胞膜蛋白,经SDS-PAGE分析,背部脂肪细胞膜蛋白与其他组织细胞膜蛋白具有较大差异,但也有一些相同的膜蛋白.以猪背部脂肪细胞膜蛋白为抗原,免疫雄性家兔,制备抗猪脂肪细胞膜蛋白血清,经酶联免疫反应(ELISA)测定,血清效价达到1∶12800.同样,用ELISA和Western-blotting测定抗体与其他组织细胞膜的交叉反应,结果显示:抗猪脂肪细胞膜抗体与其他组织细胞膜有交叉反应,但反应性不高.

抗猪脂肪细胞膜抗体库的构建

通过免疫方法降低猪脂肪含量、提高胴体品质成为人们研究的一个新课题,噬菌体展示技术的完善与发展为实现这一研究目的提供了条件,成为制备高亲和性抗体的有力工具。用猪脂肪细胞免疫小鼠,提取mRNA,反转录成cDNA。通过PCR扩增出重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL,再用编码(Gly4Ser)3的Linker将VH、VL连接在一起,克隆入pCANTAB5E中,转化大肠杆菌,经辅助噬菌体M13K07超感染,构建噬菌体抗体库并进行筛选。

猪脂肪细胞膜的检测及对小白鼠生长的影响

采用猪脂肪制备脂肪细胞膜抗原 ,免疫兔子制备抗血清 ,注射小白鼠 ,具有促进生长的作用。利用蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)可分离膜蛋白 ,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)可快速、简单地检测到抗体。

miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响

为研究miRNA-27b-3p对猪脂肪前体细胞分化的影响,试验首先对miRNA-27b-3p的靶基因进行预测,然后将miRNA-27b-3p和阴性对照分别转染猪脂肪前体细胞,使用qRT-PCR和ELISA试剂盒检测靶基因在24、48 h转录水平和翻译水平的表达量;甘油三酯检测试剂盒检测脂肪前体细胞中甘油三酯的含量。预测结果显示,miRNA-27b-3p靶向调控影响脂肪沉积的关键基因LPL(脂蛋白酯酶基因);qRT-PCR结果显示,miRNA-27b-3p转染24 h后猪脂肪前体细胞中LPL基因的表达量极显著下调(P<0.01),而转染48 h无明显差异;ELISA结果显示,miRNA-27b-3p转染24 h后猪脂肪前体细胞中LPL蛋白表达量显著下调(P<0.05),转染48 h后猪脂肪前体细胞中LPL蛋白表达受到极显著抑制(P<0.01);甘油三酯检测结果显示,猪脂肪前体细胞中的甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。结论:miRNA-27b-3p可以靶向调控LPL基因的表达,抑制猪脂肪前体细胞的分化。

植物油预乳状液替代猪脂肪对法兰克福香肠品质特性的影响

将1 g/100 mL氧化绿原酸添加到以猪血浆蛋白水解物作为乳化剂所制备的水包油型乳状液中,以此获得高稳定性的植物油预乳状液。然后将该预乳状液以15%、30%、45%和60%的比例替代猪脂肪加入到法兰克福香肠中,探讨替代脂肪比例对香肠品质特性的影响。测定香肠的蒸煮损失、质构、色度以及水分迁移规律,同时测定肉糜的乳化稳定性和流变特性。结果表明,随着预乳状液替代比例的增加,香肠的蒸煮损失显著降低(P<0.05),硬度、咀嚼性、L*值和b*值显著增加(P<0.05),而弹性、黏结性、感官评价无显著变化(P>0.05)。低场核磁研究结果发现,预乳状液替代比例的增加能够显著缩短香肠的弛豫时间(P<0.05),说明其能增强蛋白质网络对水分子的束缚能力。与此同时,随着预乳状液替代比例的增加,肉糜的乳化稳定性显著增加(P<0.05)。另外,肉糜的流变学测定结果表明,随着预乳状液替代比例的增加能够显著提高肉糜在加热终点的储能模量(G’)和损失模量(G′′),而且显著降低了相位角正切值(tanδ)(P<0.05)。在法兰克福香肠的制作中猪脂肪能够被预乳状液部分替代,而且对香肠的感官无显著影响,尤其以45%的替代量为最佳。

1,3-DG猪脂肪微胶囊的制备及其特性分析

为减少1,3-甘油二酯(1,3-DG)猪脂肪的氧化,延长产品的货架期。以海藻酸钠为壁材,1,3-DG猪脂肪为芯材,蔗糖酯为乳化剂,通过微胶囊造粒仪制备1,3-DG猪脂肪微胶囊,并以包埋率为指标,采用单因素试验和响应面分析法对1,3-DG猪脂肪微胶囊的制备工艺进行优化;对其基本理化指标、形态特征、氧化稳定性和贮藏稳定性进行测定分析。结果表明:微胶囊造粒仪最佳工作条件为,凝结剂Ca Cl2浓度为100 mmol/L,造粒仪频率为1 000 Hz,压力为0.06 MPa;微胶囊化最佳配方为:壁材浓度1.4%,芯壁质量比为1∶1.9,乳化剂的添加量为2.8%。在此条件下,微胶囊包埋率为85.2%,其水分活度为0.227、灰分为1.98%、粒度分布在280μm左右。

猪脂肪干细胞体外多向分化潜能的实验研究

目的探讨猪脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs)在体外是否具有多向分化潜能。方法从猪项背部皮下脂肪组织中获取ADSCs,经过体外培养扩增至第2代分别进行成软骨细胞、成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化,通过免疫荧光和RT-PCR对其相关表型进行检测。结果猪ADSCs在体外成软骨诱导分化2周后有特异软骨基质Ⅱ型胶原和Aggrecan表达,RT-PCR检测显示有Ⅱ型胶原、Aggrecan和Sox-9mRNA的表达;体外成骨诱导分化2周后有与成骨相关的OPN、OCN和ONN表达;体外成脂肪诱导2周后,经油红染色显示细胞内有脂滴形成。结论猪ADSCs在体外具有向成软骨细胞、成骨细胞和成脂肪细胞分化的潜能。

富含1,3-甘油二酯猪脂肪的热稳定性分析

以酶法改性富含1,3-甘油二酯(diglyceride,DG)的猪脂为原料,采用烘箱法模拟加热过程,研究长时间高温加热对改性猪脂中脂肪酸成分的影响,并结合酸价(acid value,AV)、过氧化值(peroxide value,POV)、丙二醛含量(malondialdehyde,MDA)和羰基价(carbonyl group value,CGV)等指标的变化分析,探究热处理对富含1,3-DG猪脂肪品质的影响。结果表明,随着加热温度的升高和加热时间的延长,改性猪脂中饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)及反式脂肪酸(trans-fatty acids,TFAs)含量逐渐上升,多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)含量逐渐下降,单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)含量在150、180℃加热时逐渐上升,在210℃加热4 h达到最大值后开始降低。改性猪脂受热过程中,其酸价较稳定,过氧化值随受热强度的增强而升高,但上升趋势随着温度增高变缓,丙二醛含量与受热强度呈正相关变化,在150、180℃加热4 h,210℃加热2 h分别达到最大值后开始降低,羰基价亦与受热强度呈正相关变化,并于加热210℃6 h后超过国家煎炸油标准(50 meq/kg)。结论:改性猪脂在高温长时间下加热会导致油脂品质下降,且加热时间越长、加热温度越高品质劣变越明显,因此改性猪脂要避免在高温长时间下加热。

猪脂肪控制氧化条件优化研究

研究影响猪脂氧化的因素,确定最佳氧化条件,为美拉德热反应制备肉味香精提供较优前提物质,设计单因素实验与正交试验,通过控制氧化温度、空气流量、氧化时间获得氧化猪脂,并测定氧化猪脂的酸价(AV)、过氧化值(POV)、茴香胺值(P-AV)确定猪脂氧化较优工艺,得出猪脂控制氧化的较优工艺条件是:反应温度120℃,反应时间2h,空气流速0. 4L/min。

酶法改性1,3-DG猪脂肪的安全性评价

评估酶法改性1,3-DG猪脂肪的安全性,并为其开发利用提供科学依据。依据《食品安全性毒理学评价程序和方法》,以KM小鼠和SD大鼠为受试动物进行急性毒性、遗传毒性试验(包括Ames试验、红细胞微核试验和显性致死试验)以及28 d经口毒性试验。急性毒性试验表明,经口灌胃酶法改性1,3-DG猪脂肪,未见明显异常,LD_(50)>17 g/kg,该物质为无毒级。遗传毒性3项试验结果为阴性,未表现出致突变性。28 d经口毒性试验表明,各剂量组大鼠临床检查正常,体重、进食量、食物利用率、血常规、血生化、脏体比等各项指标均在正常范围内,与空白对照组相比差异不显著(p>0.05);组织病理学观察并未发现病理改变。研究表明酶法改性1,3-DG猪脂肪是安全无毒的可食用油脂。