红斑丹毒丝菌对猪脐静脉内皮细胞的感染及细胞增殖凋亡的影响

猪感染红斑丹毒丝菌后会表现出明显的皮肤和血管病变,为了解红斑丹毒丝菌感染后对血管内皮细胞的影响,本研究建立了红斑丹毒丝菌体外感染猪脐静脉内皮细胞模型;利用革兰染色、菌落平板培养法等检测红斑丹毒丝菌对猪脐静脉内皮细胞的黏附能力;采用CCK-8、Ed U、Annexin V-PE等试剂盒分别检测红斑丹毒丝菌对血管内皮细胞的活力、增殖及凋亡的影响。结果显示,红斑丹毒丝菌易黏附和侵入猪脐静脉内皮细胞,损伤细胞活力,抑制其细胞增殖并显著诱导其凋亡。本文揭示了红斑丹毒丝菌感染可能会通过抑制猪血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡而导致机体血管系统病变的机制,为猪丹毒的预防及治疗提供了参考。

分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达

为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。

猪脐静脉血管内皮细胞分离培养和鉴定

为了建立成熟的猪脐静脉血管内皮细胞（SUVECs）分离培养和鉴定体系,采用1%的I型胶原酶灌注法分离细胞,计数板计数,以10%1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养;待融合80%左右胰蛋白酶消化1：2传代,利用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态;采用血管性血友病因子（VWF）和血小板-内皮细胞粘附分子（PECAM-1/CD31）进行免疫荧光细胞鉴定;利用ICELLigence细胞功能分析仪测定细胞活力和生长曲线。研究从30头新生仔猪脐带（8-15cm）中分离到超过107个细胞,VWF和CD31双重检测阳性,分离得到的SUVECs超过90%,细胞生长状态良好,呈小三角形、椭圆形、梭形、多边形单层生长,界限清晰,融合后呈铺路石状,增殖能力强,符合血管内皮细胞的基本特征,可培养超过15代,为进一步研究猪胎盘血管发生及其对母猪生产性能影响提供可靠细胞模型。

猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选

本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重组载体与microRNA的抑制物,最后通过发光检测仪测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了CSFV5′非翻译区(373 bp)和3′非翻译区(252 bp)的报告基因载体,并合成了4条预测出的microRNA(ssc-mi R-let7c、ssc-mi R-106a、ssc-mi R-18、ssc-mi R-139)的抑制物,共转染后发光检测仪检测到荧光素酶的活性被不同程度抑制。本研究发现microRNA作用位点主要在CSFV的3′-UTR,而且以上4种microRNA都对CSFV3′-UTR有不同程度的抑制作用,其中ssc-mi R-18的抑制作用比较明显。

经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

【目的】研究猪瘟病毒（CSFV）E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%-99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%-99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。

猪细胞周期蛋白A基因的克隆及其功能研究

本研究旨在克隆猪细胞周期蛋白A基因(CyclinA),并在猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)中表达,以验证其功能。以人的CyclinA基因为信息探针,经电子克隆得到猪CyclinA基因,通过RT-PCR和DNA测序验证电子克隆结果并对其作生物信息学分析,用RT-PCR、Westernblot研究它在SUVEC中的表达情况。应用激光共聚焦显微镜分析它在细胞中的亚细胞定位,并通过流式细胞仪分析细胞周期以及用MTS法测定细胞的增殖能力。结果如下:核酸测序证明RT-PCR产物同电子克隆结果相符。该cDNA包含1299bp的完整开放阅读框(ORF),共编码432个氨基酸,经NCBIBLAST分析,该基因定位于猪的8号染色体上。Westernblot结果显示CyclinA基因编码蛋白的相对分子质量大小约为40ku,亚细胞定位研究表明该蛋白定位于细胞核中。经流式细胞仪分析表明稳定表达该基因的细胞,其G1期的细胞数量比对照组细胞增加了15%～20%,而S期的细胞数量比对照组细胞减少了约18%;MTS法检测显示细胞株SUVEC-CycAGFP的增殖活性明显高于对照组细胞。作者成功克隆到新基因猪源细胞周期蛋白A,并验证了其生物学功能,为今后开展病毒感染对猪细胞周期蛋白A影响的研究奠定了基础。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

猪PDCD5基因的克隆与真核表达

用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.